一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 堿裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）壓力下蒸汽滅菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱層析進一步純化所制備的質粒 DNA，無菌的堿裂解液Ⅰ在使用前可補充以適當體積的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之終濃度為 100 μg/ml，若欲用其他的方法純化 DNA，則不推薦在此步驟添加 RNA 酶。
(2) 堿裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（從 10 N 貯存液中現用現稀釋）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要現用現配，室溫下使用。
(3) 堿裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸鉀 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中鉀的濃度為 3 mol/L，乙酸根的濃度為 5 mol/L。保存于 4℃，用時置于冰浴中。
(4) 用于篩選質粒的抗生素
(5) 氯霉素（34 mg/ml）
(6) 乙醇
(7) 異丙醇
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）
2. 酶和緩沖液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml）
(2) 限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
4. 培養基
LB、YT 或 Terrific 培養液
5. 離心機和轉頭
Sorvall CSA 轉頭或與之相當的轉頭。
二、方法
1. 細胞的制備
(1) 挑取轉化細菌的單菌落（或用 0.1~1.0 ml 單菌落的培養物），接種到 30 ml 含適當抗生素的培養基（LB、YT 或 Terrific 培養液）中。
為了確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管不宜蓋得過緊；應在劇烈振搖下溫育。
(2) 在適當的溫度和搖速下培養菌液直至對數生長期晚期（OD600 約為 0.6）。
(3) 在含 500 ml LB、YT 或 Terrific 培養液（預熱到 37℃）及適當抗生素的燒瓶（2 L）中接種 25 ml 對數生長期晚期的菌液。將此培養液在 37℃ 劇烈振搖（300 r/min）培養約 2.5 h。
最后菌液的 OD600 值應約為 0.4。由于不用菌株的生長速度不同，可稍微延長或縮短培養時間，使最終的 OD 值為 0.4。
(4) 若質粒為低或中拷貝數的松弛型質粒，在培養液中添加 2.5 ml 濃度為 34 mg/ml 的氯霉素，使其終濃度為 170 μg/ml。
重要：對于高拷貝數的質粒，不必添加氯霉素。
(5) 于 37℃，以 300 r/min 劇烈振蕩再培養 12~16 h。
(6) 取部分菌液（1~2 ml）到離心管中，4℃ 貯存。于 4℃，以 2700 g（對于 Sorvall GSA 轉子是 4100 r/min）離心 15 min 以收集余下的近 500 ml 培養物。棄上清，倒置離心管使殘余的上清流出。
(7) 用 200 ml 冰預冷的 STE 重懸細菌沉淀，按步驟 6 所述重新收集細菌并貯存于 -20℃。
(8) 用步驟 6 中貯存的 1~2 ml 菌液提取質粒（可使用方案 1 或 4 中的任一種方法），采用酶切和瓊脂糖電泳分析此小量制備質粒，以確定大量培養菌液中正確的質粒已得以擴增。
設置這種對照可能看上去有點過于謹慎，然而它可以避免發生某些可能難以挽回的、浪費大量時間的錯誤。
2. 細胞的裂解
(1) 將步驟 7 中凍存的細菌在室溫下放置 5~10 min 使其解凍后，用 18 ml (10 ml）堿裂解液Ⅰ重懸。
只有步驟 4 中使用了氯霉素的菌液才應參照括號中的體積數。
(2) 加 2 ml ( 1 ml）新配置的 10 mg/ml 溶菌酶。
(3) 加 40 ml（20 ml）新配置的堿裂解液Ⅱ。蓋上離心管蓋，輕輕顛倒數次，徹底混勻，室溫下放置 5~10 min。
延長超螺旋 DNA 暴露于堿的時間會使其不可逆變性（Vinograd and Lebowitz 1996），所產生的環狀卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋 DNA 的兩倍，難以被溴化乙錠染色。從細菌中用堿裂解法提質粒時可能會看到微量的這種 DNA。
(4) 加 20 ml（15 ml）冰預冷的堿裂解液Ⅲ。蓋上離心管蓋，輕輕地但完全地振蕩混勻幾次（此時應不再有分離的兩個液相）。將離心管在冰上放置 10 min。
在放置過程中會出現由染色體 DNA、高分子質量 RNA、鉀離子/SDS/蛋白質/細胞壁復含物一起形成的乳白色沉淀。在堿裂解液Ⅲ中最好使用醋酸鉀而非醋酸鈉，因為十二烷基硫酸鉀鹽遠比鈉鹽難溶。
(5) 在 4℃ 用 20000 g 離心堿裂解液（或 Sorvall GSA 轉頭，11000 r/min）30 min，無須制動，讓轉頭自然停止。將上清輕輕移入量筒中，棄去離心管中的沉淀。
不能形成緊密的沉淀的原因常常是加入裂解液Ⅱ時混勻不充分。如果細菌碎片不能形成緊密的沉淀，以 20000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 11000 r/min）再次離心 15 min，然后將上淸盡量移入干凈的離心管中。轉移的時候使用四層紗布過濾上清可以除去黏稠的基因組 DNA 和蛋白質沉淀殘余。
3. 質粒 DNA 的回收
(1) 量取上清的體積，將其連同 0.6 倍體積的異丙醇一起移入一只潔凈離心管中并將其充分混勻，室溫下放置 10 min。
(2) 在室溫下以 12000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 8000 r/min）離心 15 min 回收核酸沉淀。
若在 4℃ 下離心會使鹽也沉淀下來。
(3) 小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾上以除去殘余的上清。在室溫下用 70% 的乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用與真空管道相連的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。將離心管開口倒置于紙巾上使剩余的乙醇揮發掉。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情況下它會變得難以溶解并且可能變性（Svaren et al. 1987），將沉淀在室溫下干燥 10~15 min 對于乙醇揮發來說足夠了，而且不會引起 DNA 脫水。
(4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解濕潤的核酸沉淀。
(5) 粗制質粒 DNA 的純化可用柱層析法，聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙錠梯度離心法。
(6) 用限制酶酶切及凝膠電泳分析確證質粒的結構。
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