SLAFseq技術：大規模基因分型高通量策略

大規模基因分型在遺傳相關性研究中起著重要作用，尤其是和高通量測序技術結合后，它為基因挖掘帶來了新的機遇。大規模基因分型的有效解決方法：SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing），該技術前期利用生物信息學方法，對目標物種的參考基因組（或已知BAC序列）進行系統分析，設計標記開發方案，后期根據前期的方案，構建SLAF-seq文庫，篩選特異性長度片段進行高通量測序，將獲得測序深度和質量滿足要求的SLAF片段來代表目標物種的全基因組信息。它具有以下優勢:

1.  高深度測序保證分型準確；

2.  簡化的策略降低測序成本；

3.  前期簡化方案預測保障標記數量最優；

4.  采用double index技術能適用于大群體。

在文章中，我們用水稻和大豆數據驗證了SLAF-seq技術的有效性，2個結果都顯示預測的和實際的結果一致性非常高，同樣基因分型也非常準確。我們還利用這個技術構建了鯉魚的高密度遺傳圖譜（物種高雜合且無參考基因組），對2個親本和211個子代進行簡化測序，得到50,530個SLAF標簽，構建了50條連鎖群，上圖標記5885，標記平均距離0.68 cM。將得到的連鎖群與鯉魚的近緣物種斑馬魚進行比較基因組學研究，結果顯示鯉魚的2條連鎖群對應斑馬魚的1條染色體，二者的共線性良好，說明高質量的SLAF分型結果。

SLAF-seq技術為大規模基因分型提供了一個高通量的策略，并且能應用于不同物種和群體，適用性非常廣。SLAF標記的質量評估部分的基本原理，采用基因分型質量評分對標記質量進行評估。質量評分采用PHRED 公式的算法，錯誤率數據用新的方法得到。文章中，對于SLAF簡化效率的評估方式和結論，通過仿真研究發現4 以上的測序深度能夠保證SLAF的準確性。對鯉魚4.28×的測序進一步驗證，SLAF的質量能將錯誤率控制在3%(5/190)以內。

SLAF的技術流程：

（1）預實驗：用rice 和soybeans 等training data確定酶和酶切片段大小。

（2）構建文庫：包括酶切，連接，PCR反應，凝膠電泳過程。

（3）基因分型：采用配對雙末端測序獲得短片段DNA序列信息，用軟件定義和評估基因型。

下圖所反映的分析流程展示如何用質量評分選擇高質量遺傳標記和個體的動態優化過程。首先對每個SLAF和個體計算低質量的標記。刪除標記質量最差的SLAF和個體。重復以上過程，直到所有SLAF標記的平均質量分達到13。通過計算標記或者個體的低質量基因型數量，反復刪除標記或者個體，最終使標記平均質量值達到閾值，文章中最終得到7559個標記和160個體。

SLAF標記的質量評估部分的基本原理是貝葉斯方法驗證分型準確性，通過基因型覆蓋度和多態性計算個體在某個標記位點擁有某個基因型的概率，綜合考慮測序深度和測序錯誤率將每個基因型進行打分。以分值大小評估標記質量。文章中，對于SLAF簡化效率的評估方式和結論，實際標記數和預測值盡量接近；SLAF均勻分布于基因組上；、避免重復序列。遺傳圖譜評估的方案和結果，研究重組斷點，檢查重組斷點的準確性；比對同源物種，檢查同源性。只有1.51%分型可疑，25.6%的標記唯一比對到斑馬魚基因組，且有良好的共線性。

SLAF技術結合了位點特異性擴增和高通量測序，可以用于全基因組范圍的De Novo SNP開發和大范圍的基因分型。為了提高片段選擇的高效性，生物信息統計模型被開發出來，用于進行特定位點選擇的擴增，這種是基于training 數據的。它包含稀有序列BAC序列和基因組草圖序列。這種training 數據事從靶標組織或者其他與進化相關的組織，甚至是GC含量相似的組織中提取的。SLAF高效選擇模式能被發展為training 數據，我們分析了幾個training 數據組，基因組內重復序列可以被高效的避免。