SPA夾心ELISA試驗檢測循環復合物...

實驗概要

金黃色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)可與IC中IgG的Fc段結合。將待測血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上，再以酶標記的SPA與之反應，即可檢測樣本中有無IC。

主要試劑

1. 5％與2.5％PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制。
2. 牛血清白蛋白(BSA)緩沖液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1％硫柳汞，0.05％Tween 20，4％BSA。
3. HRP—SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶(HRP)制成結合物。最適工作濃度以方陣法滴定。
4. 熱聚合人IgG：人IgG 10mg/mL，63℃加熱20min制成。

實驗步驟

1. 用PBS稀釋SPA成5Ps/mL，包被聚苯乙烯反應板微孔，每孔0.1mL(對照孔不包被)，置4℃過夜后洗滌3次備用。
2. 待測血清0.05mL加PBS0.15mL和5％PEG0.2mL混勻，4℃過夜后1 600r/min離心20min，棄上清，沉淀用2.5％PEG洗2次，加入PBS0.2mL和BSA緩沖液0.2mL，混勻，置37℃水浴30min，搖動，使完全溶解。
3. 將已溶解的待測血清沉淀物加至上述包被孔和對照孔中，置37℃ 60min，洗3次；各孔加底物溶液(OPD-H₂O₂)0.1mL，37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH₂SO₄1滴終止反應。置酶標儀492nm測各孔吸光值。
4. 標準曲線制備取正常人血清0.2mL，加熱聚合人IsC(120ug/mL)0.2mL，再加PBS0.4mL和5％PEG0.8mL，置4℃過夜。同時做不加熱聚合人耽的正常血清對照，以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標本操作。用稀釋的BSA緩沖液(加等量0.01 mol/LpH7.4PBS)1.6mL溶解并稀釋成120、60、30、15、7.5ug/mL，與待測血清同法操作，制成工作標準曲線。
5. 結果判斷從待測血清吸光度值查標準曲線，即可換算成相當于熱聚合人IgG的CIC含量(ug/ml)。以高于正常對照X加2S，即大于28.4ug/mL為陽性。

注意事項

1. 熱聚合人IgC應分裝貯存于-20℃，不宜反復凍融，否則易解聚。
2. PEG的濃度影響CIC沉淀量，須嚴格配制。