SYBRGreen法實時定量PCR優化攻略

SYBR? Green是一種插入DNA分子的染料，具有多種分子生物學應用，其中之一就是用于實時定量PCR（qPCR）。隨著PCR循環的連續進行，這種染料的熒光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應中的DNA進行定量。SYBR Green法及一些其他基于染料的qPCR方法比探針法的成本低，使用也更為方便。不過這些方法也存在著與生俱來的弊端，SYBR Green方法產生的非特異性產物較多，會導致高背景和假陽性。盡管如此，SYBR Green法這一久經考驗的技術仍然頗為流行，有大量的研究人員是SYBR Green法的忠實擁護者，愿意接受這一技術的小瑕疵。當然供應商們也各展所長，開發了各式各樣的產品來幫您優化這一qPCR的經典方法。

熱啟動的長處

熱啟動PCR方法能夠在反應開始前避免非特異性擴增。熱啟動技術一般是依賴經修飾的酶、引物或者抗體對聚合酶進行抑制，直到系統達到變性溫度。

Sigma公司生命科學部qPCR試劑全球產品Eric Reyes稱，該公司zui新的熱啟動產品KiCqStart? SYBR Green qPCR ReadyMix?比同類產品性能更優，并且可以針對如今試驗室中的各類實時定量PCR儀提供相應配方的產品。KiCqStart SYBR Green ReadyMix產品是2X濃度的即用型試劑，包括SYBR Green I、抗體介導的熱啟動Taq DNA聚合酶、核苷酸和MgCl2，外加緩沖液和穩定劑。該產品只需客戶加入引物和模版，免去了繁復的SYBR Green優化流程，實際上該產品也的確不需要進行優化。

較難擴增的目標

有些目標較難擴增，為了解決這一問題，Life Technologies公司近期發布了SYBR Select Master Mix。依據Life Technologies基因分析產品主管Sobha Pisharody的說法，該產品的zui大優勢在于特異性和可重復性更高，超越了目前市面上的其他SYBR混合液。SYBR Select包括一個熱不穩定性尿嘧啶糖基化酶UDG，用于去除可能干擾擴增的污染模板。“混合液中含有UDG可能造成一些問題，”Pisharody說。“有時甚至會破壞反應，因為它并不總能一受熱就滅活。”

dUTP的利與弊

擴增產物有時會影響后續PCR反應，導致假陽性結果。控制這種情況的方法之一就是在PCR產物中用dUTP取代dTTP，隨后再用UDG處理所有的后續反應。UDG能夠將尿嘧啶從其磷酸二酯主干上切除下來，但不影響天然DNA。

熱不穩定性UDG在完成清理任務后，可以受熱自動失活。“這一產品能使客戶的實驗更容易獲得成功，”Pisharody說。“客戶使用SYBR遇到的主要問題之一，是需要反復進行引物設計、試驗、重新設計引物，而這一混合液的特異性可以幫助人們大大簡化這一過程。”

不過，dUTP方法也存在著缺陷。只有當同一個儀器上的所用用戶都使用dUTP清理系統時，該方法才有效。即使該研究組中只有一位成員不使用dUTP清理系統，這種控制方法就會失效。此外使用dUTP被認為是一種低效率的方法，因為dUTP會使反應的效率降低，Ct值增大。

Meridian生命科學公司旗下的Bioline就因此不再銷售帶有dUTP的PCR試劑盒。該公司向用戶推薦了一種優化步驟，包括使用一次性耗材、帶過濾芯的吸頭以及分隔擴增區域，將潔凈的實驗室操作與高特異性的實時定量PCR起來。Bioline的SensiFAST?系列試劑盒不僅提供用于SYBR Green法的實時定量PCR產品，同樣也提供探針法產品供您選擇。

快、還要更快

目前，許多實驗室都在尋求qPCR的快速方案，例如將兩小時的實驗方案縮短至45分鐘或者1小時。快速PCR通常意味著價格水漲船高的儀器和不菲的資金投入，不過其實調整標準儀器的參數也能夠實現快速PCR，例如可將qPCR的標準三步流程合并為兩步（合并退火和延伸過程）。而相應的試劑和耗材（例如新型熱啟動酶）也能幫您進一步節省時間。

Bio-Rad公司的SsoAdvanced? SYBR Green supermix中包含與雙鏈DNA結合的蛋白Sso7d融合酶，這種酶能夠穩定聚合酶-模板復合物，提高PCR反應的持續合成能力、抑制劑耐受力和反應速度。Bio-Rad的資料顯示，這一混合液能夠提高qPCR的速度而不會對反應的特異性、敏感性和效率產生絲毫影響。

此外，Bio-Rad公司還提供iTaq? Universal SYBR Green Supermix。“這種SYBR Green supermix的優勢在于，它的儀器兼容性非常廣泛，并且能夠在多種反應條件下生成優異的qPCR數據，”Bio-Rad 的PCR試劑產品Ramesh Sathiyaa介紹道。

Thermo Scientific公司的DyNAmo? Flash SYBR Green qPCR試劑盒也是一款專門為快速PCR設計的產品。該產品依賴于經過修飾的Thermus brockianus DNA聚合酶，將這種酶的熱啟動版與SYBR Green I染料相結合。該公司的技術人員通過非特異性DNA結合域的融合使T. brockianus聚合酶更加穩定性，并且在室溫下不具活性。該試劑盒的ColorFlash版更整合了特殊染料，其中master mix含有藍色染料針，而樣品緩沖液含黃色染料（樣品孔），這樣當樣品和master mix混合后就會呈現綠色。這一顏色體系可以確保移液的正確性，幫您輕松告別加樣失誤。

替代品

羅氏公司的技術服務顧問Joe Donnehoffer正在嘗試引導客戶放棄SYBR Green，“如果客戶正在使用SYBR Green并且需求用于降低非特異性的產品，我們會推薦他們使用UPL通用探針庫”。

Donnehoffer還向強烈執著于SYBR Green的客戶推薦了一款替代性染料，LightCycler 480 ResoLight Dye。與SYBR Green不同，ResoLight能夠充滿DNA分子片段，生成準確的熔解曲線。而SYBR Green I分子就無法做到這一點，染料分子在解鏈階段會在DNA鏈之間“跳躍”。

Donnehoffer也提到人們對于SYBR Green的偏愛可能較難改變。“使用SYBR Green的客戶……并不情愿采用另一種不同的方法。”因此，他也并不指望SYBR Green會在近期退出實驗室的應用舞臺。

Life Technologies公司也有相應的替代性染料提供，該公司的SYBR GreenER?比SYBR Green I更亮，對PCR反應的抑制也更小。

預證引物

正所謂成也蕭何敗蕭何，引物設計在一個qPCR實驗中非常關鍵。實際上您可以在引物數據庫中尋找適合自己的引物設計，這類數據庫包括RTPrimerDB、PrimerBank和qPrimerDepot等，其中的引物設計都是被驗證過的。

市面上也有不少預證引物的產品。例如Qiagen公司的QuantiTect Primer Assay就是特別為SYBR Green法設計的qPCR引物對，具有高度的敏感性和特異性，PCR效率能達到100%。該產品系列覆蓋了人類、大鼠、小鼠、果蠅、擬南芥等物種的基因，更經過專家的反復驗證和優化，與Qiagen公司的QuantiFast、QuantiTect、Rotor-Gene或者FastLane SYBR Green試劑盒一同使用實驗結果就更有保障了。根據Qiagen公司的資料，即使在標準qPCR儀上使用，QuantiFast SYBR Green試劑盒也能幫您省下60%的時間。

OriGene公司也有預證引物產品提供，其SensiMix qPCR引物對就能用于SYBR Green法qPCR，該產品也是OriGene公司獨有算法的結晶。OriGene公司的預證引物產品覆蓋了人類和小鼠的整個基因組。

此外，Sigma公司也發布了為人類、小鼠和大鼠轉錄組設計的KiCqStart預證引物，Sigma公司OEM、分子診斷和qPCR探針的全球產品Tom Russell介紹道。這些引物比市面上的其他預證引物更經濟，購買該產品也更為便利，“我們在世界各地都設有生產機構，”Russell說。

在qPCR復雜冗長的優化過程中，往往需要不斷進行實驗，逐步改進引物設計，甚至重復訂購試劑，不知不覺就耗費了我們大量的時間和精力，從這方面看預證引物和試劑盒絕對是物超所值。