Science深度綜述：冷凍電鏡的激蕩40年

　　“It is very easy to answer many fundamental biological questions； you just look at the thing!”——1965年諾貝爾物理學獎得主理查德?費曼教授

　　正如費曼教授所言，結構生物學的核心正在于“看清事物”。只要分辨率足夠高，能看清諸多生物分子在原子層面上的細節，它們的工作方式也就不言自明了。也正是由于這個原因，從歷史上看，結構生物學領域做出的發現，帶來了許多生物學突破，也推動了不少創新療法的開發。

　　在諸多讓人類“高清看世界”的技術里，X射線晶體學是生物學家們使用最多的技術之一，也讓人類獲得了大量生物大分子的結構。但這種方法需要事先獲取這種大分子的晶體。盡管許多蛋白質和一些穩定的復合體能產生質量足夠高的晶體，但對于膜蛋白或動態的復合體來說，獲取晶體就不是那么容易。

　　我們能不依賴于晶體獲取，直接“觀察”這些大分子嗎？自上世紀70年代起，許多先驅嘗試使用基于電子顯微鏡的方法來解決這個問題。最初，它的分辨率并不盡如人意。但經歷了40年的發展，冷凍電鏡技術取得了突破，一躍成為了結構生物學的主流工具之一，與X射線晶體學形成了完美的互補。

　　單粒子冷凍電鏡的誕生

　　事實上，想通過電子顯微鏡來看清生物大分子，并不是一件容易的事。首先，和通常的照片一樣，電子顯微鏡獲取的圖像是二維的，而生物大分子的結構是三維的。這一問題通過一個巧妙的方法得到了解決：對于同一個生物大分子，我們可以從不同的角度獲取它的二維圖片。將這些圖片整合到一起，就可以重建出三維的結構。

　　而電子顯微鏡遇到的另一個問題，曾一度被認為是它的致命硬傷——為了達到最佳效果，電子束必須處于真空環境之中。于是，這些樣本也必須位于同樣的真空里。對于生物大分子來說，這就造成了嚴重問題：真空導致的脫水會對樣本的結構完整性帶來破壞性的影響。從機制上看，用電子顯微鏡來觀察生物大分子就好像是個不可能完成的任務。

▲將樣品“凍起來”，可以保留生物大分子的完整性（圖片來源：By Vossman [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)], from Wikimedia Commons）

　　1974年發表在《科學》雜志上的一項研究彰顯了人類的智慧。在加州大學伯克利分校，還是在讀研究生的Kenneth Taylor與其導師Robert Glaeser教授表明，生物大分子的結構完整性，可以通過將它們“凍起來”而得到保留。這一發現在上世紀80年代被Jacques Dubochet教授及其同事們發揚光大，基于這一發現開發的樣本制備技術時至今日都沒有出現很大的改動。

　　研究人員們也指出了電子顯微鏡的第三個問題——高能電子束帶來的輻射可能會對生物學樣本造成破壞，從而限制了電子束的強度。而電子束較弱的結果，便是過低的信噪比。Richard Henderson教授等人提出的一個解決方案，將晶體學中的技術應用到電子顯微鏡成像過程中。利用電子晶體學（electron crystallography）技術，人們取得了一系列進展，解析出的結構分辨率最高達1.9 ?。

▲三位在冷凍電鏡領域做出開拓性貢獻的科學家共享了2017年的諾貝爾化學獎（圖片來源：The Nobel Prize in Chemistry 2017. NobelPrize.org. Nobel Media AB 2018. Wed. 12 Sep 2018.）

　　而Joachim Frank教授則希望能夠規避結晶這一手段來確認蛋白質的結構。他提出，通過對同一種蛋白粒子進行大量的獨立拍攝，再通過計算機來整合這些圖片，有望能獲得高清的結構。這一創新的想法與樣本的冷凍制備相結合，成為了如今我們熟悉的“單粒子冷凍電鏡”（single-particle cryo-EM）。Frank教授、Dubochet教授、以及Henderson教授三人也共享了2017年的諾貝爾化學獎。

　　結構生物學的新紀元

　　單粒子冷凍電鏡技術為結構生物學帶來了新的突破，使其邁入了新紀元。原本難以結晶的目標，其結構也能展現在人類面前，膜蛋白就是這樣的例子。在這篇綜述中，加州大學舊金山分校的程亦凡教授介紹了冷凍電鏡如何協助我們獲得了瞬態受體電位（TRP）離子通道的結構。

▲本篇《科學》綜述的作者程亦凡教授（圖片來源：程亦凡教授實驗室官網）

　　TRP通道超家族分為7大類，在人類中總共有27個成員，每一個通道都有著特定的生理功能，其中一些也有望成為治療人類疾病的靶點。但除了這些通道里的少數小型結構域外，人們對這些通道的結晶嘗試往往以失敗而告終，這也限制了對這些靶點的進一步開發。

　　2013年，這一困境迎來了終結。當年，《自然》上的兩篇論文利用單粒子冷凍電鏡技術，獲取了TRPV1離子通道位于三種不同狀態下的結構，讓我們更好地理解了其“感受熱量，激活疼痛通路”的作用。TRPV1結構的獲得再次強調了冷凍電鏡的巨大潛力——當“獲取晶體”這一限速步驟被移除后，我們能夠以極快的速度獲得膜蛋白的原子結構。據統計，在不到5年的時間里，每一類TRP通道，均有至少1個成員的結構得到了解析。

　　對于大型的動態復合體來說，冷凍電鏡更是讓原本無法通過結晶獲取的結構呈現在了人類面前，剪接體就是極佳的例子。過去，人們要么只能獲得其中片段的原子結構，要么只能獲得分辨率較低的整體結構。而在單粒子冷凍電鏡的協助下，在幾年里，我們就獲得了剪接體在不同工作狀態下的結構，從而拼接出了它工作的完整畫面。這在過去是難以想象的。

　　冷凍電鏡領域前所未有的發展速度，也吸引了諸多醫藥企業的關注。它們期望能夠應用這一技術，優化藥物的發現過程。

　　醫藥企業的嘗試

　　在去年11月的一篇《Nature Reviews Drug Discovery》綜述中，作者Mark Peplow博士為我們盤點了藥企在冷凍電鏡領域的布局與嘗試。

　　對于大型藥企來說，在公司內部的建立冷凍電鏡能力是其布局的主要方向——基因泰克在組建內部的冷凍電鏡團隊；輝瑞斥資500萬英鎊使用新款的冷凍電鏡；諾華通過與Friedrich Miescher研究所的合作也構建了自己的冷凍電鏡中心。諾華生物醫藥研究所（NIBR）的蛋白質科學負責人Christian Wiesmann說，他們的冷凍電鏡中心已經初見成效。利用冷凍電鏡技術，他們獲得了一款蛋白與一種小分子結合時的結構，這能指導藥物化學的開發。

　　對于另一些藥企或生物技術公司來說，他們決定組成聯盟，共同使用冷凍電鏡工具。這一方面是出于成本的考量，但更重要的是，這種聯盟能夠促進經驗的交流。在英國，劍橋醫藥冷凍電鏡聯盟（Cambridge Pharmaceutical Cryo-EM Consortium）就是這樣的例子——在5家藥企的合作下，這一聯盟獲得了超過300萬英鎊的資金，于2016年正式啟動。

　　去年5月，該聯盟的成員之一阿斯利康發表了一篇論文，揭示了人類突變ATM蛋白的結構。ATM蛋白是一類大型激酶，與DNA的修復有關，在癌癥發病中有潛在的作用。而研究人員們獲得的結構，其分辨率為4.4?，足以看清其兩個構象，其中一個處于“打開”狀態，可以結合底物；另一個則處于“關閉”狀態。這些發現帶來了該蛋白的首個高清結構，也表明它作為分子開關的重要作用。

　　該聯盟的另一個成員Heptares則在探索GPCR的結構。作為一類膜蛋白，它們通常會因為分離過程而失去正常的結構與活性，因此難以通過常規的結晶手段制備樣本。但冷凍電鏡技術則沒有這樣的困擾。目前，我們獲得的GPCR結構已能讓我們看清它們與大型多肽相結合時的結構。它們與小分子結合時的高清結構，會是研究人員們未來的研究方向。

　　冷凍電鏡的未來

　　冷凍電鏡領域在過去40年里發生了重大的改變，而這一技術還有不少可以提高的空間。其中的一大關鍵在于進一步提高分辨率，達到2?左右，另一大關鍵在于提高使用的效率。如果我們能夠快速獲得大批樣品的高清結構，無疑將加速這項革命性技術在醫藥領域的應用。

　　此外，硬件與軟件的升級，也將提升冷凍電鏡的能力。更好的光學系統、更好的檢測器、更好的算法軟件，都能讓冷凍電鏡在現有的基礎上如虎添翼。正如一些業內資深人士指出的那樣，要實現這樣的功能迭代，讓冷凍電鏡成為新藥發現的常規工具，或許還需要5到10年的時間。但對于諸多醫藥與生物技術公司而言，目前或許是將這一工具整合至研發系統中的最佳時機。