Science聚焦：以“魔剪”CRISPR為平臺，打造新一代診斷技術

　　快速且準確的診斷感染性疾病是提升臨床診療水平，以及指導感染性疾病防控和公共衛生工作，避免疫情大范圍傳播的關鍵，這一點無論對于現代化的大型醫療中心，還是在缺醫少藥的偏僻鄉鎮醫院，都是非常重要的。最理想的診斷方式應該是價格低廉、準確性高，并且是快速的，而且還應該操作簡便（無需專業人士操作即可使用），以及無需專業設備和基礎設施要求（比如電力等條件）。對于埃博拉病毒（Ebola virus）和中東呼吸綜合癥病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus）這類出現在偏僻地點，但會導致全球大范圍傳播的致病性病毒而言，如果有了這種理想中的檢測技術，就能夠幫助醫務人員在早期發現患者，將其隔離，避免疫情擴散，同時也可以給患者爭取到更多及時治療的機會。

　　研究發現，細菌和古生菌（archaea）等原核生物（prokaryotes）都具有先天的適應性免疫機制（heritable adaptive immunity），而這套免疫系統都是以最近非常熱門的基因編輯技術CRISPR-Cas系統為基礎的。近期《科學》（Science）雜志已經介紹了Chen科研團隊、 Myhrvold科研團隊和Gootenberg科研團隊的工作。他們分別利用CRISPR-Cas技術開發了革命性的分子診斷新技術，以用于發現人體標本里的寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）和人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）。同時他們也以肺癌患者的循環DNA（circulating cell-free DNA）為標本，對基因突變這類非傳染性致病因素進行了診斷。

　　原核生物在它們基因組的CRISPR位點里儲存了大量的感染性病原體（比如噬菌體、質粒和轉座子等）的遺傳信息，這些遺傳信息就是原核生物自身的“抗體（適應性免疫記憶）”。Cas蛋白通過適應（adaptation）、轉錄出crRNA和干擾（interference）等步驟，完成原核生物的適應性免疫反應。在適應階段，外源性遺傳物質被原核生物加工處理及挑選，最后整合進CRISPR位點，打下深刻的免疫記憶烙印，為今后再次遭遇該感染源做好準備。前體crRNA是一種長鏈RNA前體分子，它成熟成為crRNA之后，可以指引Cas蛋白剪切外源遺傳物質的互補鏈，這就是干擾步驟，最終使外源遺傳物質降解，消滅外來感染源。科研人員徹底弄清楚這一套原核生物免疫機制之后，就開發出了新的分子診斷技術。

　　Chen的課題組發現，當CRISPR-Cas12a蛋白以序列特異性方式切割dsDNA時，還會誘導出很強的非特異性ssDNA反式切割效應（trans-cleavage）。根據這種特點，他們開發出了一種以臨床常規采樣標本為檢測對象，快速鑒定HPV16、18型致癌病毒的新技術。通過肛門拭子（anal swabs）標本提取出HPV病毒的dsDNA，經過等溫預擴增（isothermal preamplification），然后利用重組多聚酶擴增法（recombinase polymerase amplification, RPA）進行擴增。這種DNA擴增技術是一種快速，而且不需要專門儀器的DNA擴增技術。接著，他們通過Cas12a-crRNA復合體與擴增的HPV dsDNA結合，將其降解，同時誘發dsDNA反式降解反應，以激活結合在dsDNA分子上的熒光報告因子（fluorescent reporter），發出熒光，完成整個檢測。這種新型診斷技術名為DNA內切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter, DETECTR）。該技術可以用來快速、且準確地檢測各種亞型的HPV病毒。而且由于其快速、準確、便捷的特點，尤其適合世界衛生組織推薦的大規模普查工作。

　　Myhrvold等人開發的檢測方法則是將采自患者的臨床檢測樣品里的病毒核酸直接釋放出來進行檢測，略過了常規檢測工作中的核酸提取這個步驟。這種方法被稱作不經核酸提取熱處理樣品滅活核酸酶技術（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases, HUDSON）。這種技術能夠大量滅活人體體液里的核糖核酸酶（ribonucleases），同時也可以使病毒的衣殼破裂，釋放出病毒的核酸分子。Myhrvold等人還使用了以Cas13蛋白為基礎的核酸檢測技術平臺——特異性高靈敏度酶報告系統（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）。與DETECTR系統類似，SHERLOCK系統也利用了RPA和Cas13蛋白，誘導出（非CRISPR）核酸切割反應。

　　在SHERLOCK系統里，結合了熒光報告因子的RNA被切割之后會釋放出熒光信號，該熒光信號再經酶的放大，從而極大地提高了這種檢測方法的靈敏性。Myhrvold等人將HUDSON技術和SHERLOCK系統結合起來，開發出了一種高靈敏同時高特異性的檢測方法，可用于直接對體液（包括尿液、血液、唾液、血清和血漿等）中的登革病毒和寨卡病毒進行檢測，在1至2個小時內給出檢測結果。而且樣品的制備過程也很簡單，同時也不需要很復雜的設備。在中南美洲的很多地區，登革病毒和寨卡病毒都非常常見，而且臨床表現也都差不多。如果孕婦感染了寨卡病毒，那么將極容易產下先天畸形的孩子，而且這種病毒可性傳播，因此對孕婦和她們的丈夫進行檢測就顯得尤為重要。這套HUDSON——SHERLOCK檢測技術可以很好地區分登革病毒、寨卡病毒、黃熱病毒（yellow fever virus, YFV）這些在巴西多地流行，并導致嚴重疫情的病原體。該技術還可以很好地區分四種不同亞型的登革病毒，還能夠對不同的寨卡病毒進行單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphisms, SNP）分析。這種功能可被用于多種SNP分析，比如耐藥相關SNP、毒力相關SNP、傳染性相關SNP等，從而幫助我們發現，并跟蹤新出現的病原體。Myhrvold等人還將SHERLOCK報告系統的熒光信號改造成了類似于早孕試紙條式的報告系統，這非常適合在檢測現場（point-of care）使用。

　　Gootenberg團隊使用的也是SHERLOCK技術，不過他們對其進行了改進，開發出了SHERLOCKv2檢測系統。這種系統只需通過一次反應便可同時檢測三種ssRNA靶標和一種dsDNA靶標。他們對17種CRISPR-Cas13a酶和CRISPR-Cas13b酶進行了生化檢測，然后從中挑選出3種有特殊切割活性的酶，再輔以Cas12a酶及RPA系統，最終開發出了這種能夠在90分鐘內同時檢測寨卡病毒ssRNA、人工合成ssRNA（synthetic ssRNA）、登革病毒ssRNA，以及人工合成dsDNA的檢測系統，而且檢測結果還是容易判讀的可視化結果。這種能夠同時檢測RNA和DNA的SHERLOCKv2技術非常適合用于肺炎致病病原體的鑒定。我們知道肺炎是全世界幼兒死亡的首要病因。不論是DNA病毒或者RNA病毒感染，還是同時合并了細菌感染導致的肺炎，都可以通過這種方法進行檢測。這種便捷、廉價、方便的就地肺炎診斷技術一定可以幫助偏遠地區的肺炎患者及早獲得相應的（抗菌或抗病毒）醫療救助。

　　另外一種SHERLOCKv2技術可以對靶標進行高靈敏度的定量檢測。這種簡便而又準確的檢測技術可以對醫療資源相對落后的地區的艾滋病患者進行HIV病毒滴度監測，以判斷抗病毒療法的療效，從而改善艾滋病患者的診療狀況。這種SHERLOCKv2技術還可以用來檢測非小細胞肺癌患者血液中的DNA分子的突變情況，檢測結果可以是熒光讀數，也可以是側向流免疫層析（lateral flow assays）方式，因此也可以用于液體活檢（liquid biopsy）。Gootenberg團隊在體外概念驗證試驗中，還成功應用SHERLOCKv2技術開展了基因編輯治療，糾正了結腸癌突變基因，同時也利用SHERLOCKv2技術確定了被成功修復的突變基因的數目。

　　這些新開發的診斷技術還需要與傳統檢測技術進行對比，以確保它們的靈敏性和特異性，同時還需要進行現場測試，看看是否滿足臨床檢測需要，因為不同檢測環境，以及不同操作者都有可能影響檢測結果。一旦通過了這些測試，這些新型的檢測技術就可以投入實際應用，提高偏遠地區的診療水平。在那些醫療條件落后的地區，不明原因發熱的診治是最常見，又是最難診治的，這些疾病也是死亡率很高，傳播范圍很廣的疾病。比如，每年全世界因為結核桿菌感染會使130萬人死亡，因此結核病也是死亡率最高的疾病，而早期發現、早期處置其實是可以避免這些患者死亡的。

　　這些檢測技術既可以用來研究致病病原體的耐藥問題，指導臨床用藥；也可以分析致病病原體的活力（viability），以指導感染疾病的防控工作；還可以擴展檢測范圍，讓糞便、呼吸道分泌物、腦脊液等標本都成為檢測樣品，以用于明確腸炎（enteritis）、肺炎（pneumonia）和腦膜炎（meningitis）等疾病的病因。隨著技術的發展，根據準確性、可靠性、簡便性、檢測速度、靈活性、費用等方面的考慮，還可以將這些檢測技術應用于傳染性疾病和非傳染性疾病的檢測，也可以應用于臨床、實驗室，以及野外等多種場合。