Science：外顯子組測序讓“生命密碼”解讀更容易

        簡單來說，外顯子組就是遺傳代碼中蛋白質編碼的組分，占整個基因組的1%-2%。測序儀每跑一次僅能讀取一定數量的堿基，但通過測序外顯子組，研究人員能更快地生成更多的堿基。與全基因組相比，它也可以用更低的成本做出更好的分辨率。

　　位于荷蘭內梅亨的拉德伯德大學醫學中心轉譯基因組學教授 Joris Veltman 在研究和臨床測序應用中采用美國生命技術公司的 SOLiD 測序儀。他估算，他的實驗室每年能夠測出幾千個外顯子組，但只能測出 50 個左右的全基因組。“通量是我們選擇外顯子組的主要原因。”他說。

　　還有一個是可解釋性。全基因組測序無疑會產生更多數據，包括外顯子組不具備的非編碼堿基、結構和單倍型相位信息。但人們不僅尚未弄清大多數核苷酸的作用，核苷酸改變后對功能產生的影響也是一個謎。然而，在蛋白編碼基因中錯義突變的涵義則更容易解讀。“現在，外顯子組是我們在基因組解讀中所掌控的那部分。”麻省理工學院-哈佛大學布羅德研究所基因組平臺主任 Stacey Gabriel 說。

　　因此，研究者一直在爭分奪秒地進行外顯子組測序。2010 年初僅有少數關于外顯子組測序的文章得到發表;如今，在 PubMed 中的記錄已經超過1600條。

　　Gabriel 說，布羅德研究所已經解碼了“超過十萬個左右的外顯子組”(對比哈佛大學遺傳學家 George Church 所估計的數字，迄今得到測序的人類全基因組只有約17000個)。 Gabriel 說她的儀器測序外顯子組的數量是全基因組的4倍，具有每周測序約 2000 個外顯子組的能力。這得益于超過 50 臺 Illumina HiSeq 2000 和 2500 測序儀，這些儀器大部分在國家心臟、肺與血液研究所的外顯子測序大項目課題中安裝。在該基因發掘項目中，布羅德研究所和華盛頓大學共同測出7500個外顯子組。

　　據霍華德休斯醫學研究會研究員 Richard Lifton 說，耶魯大學的十臺 HiSeq 測序儀僅在去年就解碼出了 12000 個外顯子組。作為該校遺傳學系主任，他于 2009 年發表了第一批用于臨床的外顯子組測序文章，隨后又發表了 15 篇外顯子組文章。 Lifton 說，“我們目前在一個高產的狀態，我們目前測序外顯子組的總費用是 500 美元，包括儀器的分期償還費用。”與之相比，他的實驗室只做了“非常少的”全基因組。

　　但從測序儀的角度來說則是半斤八兩——外顯子組和全基因組都是同樣的解碼方式。不同之處在于上游，也就是在測序之前的目標捕獲和文庫構建步驟。

　　雜交策略

　　外顯子組測序簡單來講就是目標富集的特殊形式，即在解碼序列之前將感興趣的遺傳片段取出的制備策略。研究者以此充分利用經費并達到效率的最大化：如果你不需要整個基因組，為什么要測它?同時，在減少每個樣品所測的堿基后，研究者能夠在更高的覆蓋度下，一次性測出更多的樣品。

　　覆蓋度是指一個給定堿基被測序儀讀取的次數。但這樣的數字是統計學給出的，并不是絕對的。30 倍的覆蓋度意味著平均每個堿基讀取了 30 次;有些堿基的讀取更頻繁，另一些則相反。對于很多應用來說這已經足夠了。然而當需要讀取非均質癌中的關鍵突變等罕見變異并用于臨床決斷時，則最好盡可能多地覆蓋給定的核苷酸。

　　一些研究者利用目標富集去選擇少量或幾百個基因進行測序。在外顯子測序中，目標序列是人類基因組的整個外顯子組分。通常來說，這大約是 30 兆堿基數的序列，用戶會補充 5’和 3’端的非翻譯區、小分子 RNA 、長非編碼轉錄本和其他選取的特定區域，這將顯著地擴大捕獲原料的數量。例如， Illumina 公司推出的 Nextera 快速捕獲外顯子組試劑盒有兩種類型：一個是捕獲 214405 個外顯子(總共 37 兆堿基)的基礎試劑盒，另一個是加入非翻譯區和小分子 RNA (達到62兆堿基)的“擴充版”試劑盒。

　　一些最早的外顯子組研究使用了基于陣列的雜交技術進行目標捕獲，包括 Lifton 和華盛頓大學基因組科學副教授Jay Shendure 在2009年的報道，這一策略后得到安捷倫科技公司和羅氏 NimbleGen 公司的商業化。但是溶液雜交法(該方法使用了一組生物素標記的寡核苷酸，可通過鏈酶親和素微球捕獲出雜交后產物)目前已經取代了這一方法。

　　事實上， NimbleGen 自此已經完全退出了微陣列的市場。安捷倫公司下一代測序產品市場主管 Yong Yi 說，雖然安捷倫仍在出售微陣列，但大部分是服務仍在于使用先前項目中同一富集工具的客戶。 Shendure 也表示，“如今產生的外顯子組絕大多數是通過溶液雜交法。”

　　Shendure 是最早利用外顯子組分析孟德爾疾病的研究者之一。經他的計算，自 2009 年使用該技術以來，“至少有 100 種新的疾病基因得到鑒定”。“這是爆炸性的顯著變化。”他接著說，外顯子組并不比全基因組神奇，它們只是提供了“一種成本可控的方式，在很多合理的問題中能夠(從基因組中)得到最想要的。”

　　在他們的外顯子工作中， Shendure 和同事使用 NimbleGen 基于溶液的 SeqCap EZ 人類外顯子組文庫 v3.0 試劑盒。 Lifton 的實驗室也在利用這一方式鑒定有關于高血壓、先天性心臟病、孤獨癥、血栓癥和其他病癥的基因。

　　Illumina 公司的 Nextera 快速捕獲外顯子組試劑盒(一種利用轉座子和優化雜交步驟的快速方法，能夠將試驗流程從若干天簡化縮短為僅一天半)同樣也是基于溶液雜交。安捷倫公司的 SureSelect 方法也是如此，這是一種布羅德研究所研發出(并仍在使用)的工具，能夠在溶液中利用 120 個單位長度的生物素標記 RNA 誘餌去捕獲目標序列，其中 88200 個 RNA 誘餌是在 SureSelect 人類全外顯子 V5+UTRs 的模塊中。

　　分子鎖

　　目標捕獲也能通過標準的聚合酶鏈式反應(例如，使用 RainDance 科技公司基于液滴的技術)來實現。或者，用戶可以嘗試所謂分子反向探針(molecular inversion probes，MIPs)或者“鎖式”探針。

　　Church 解釋說，鎖式探針“實際上就是兩個尾部相連的 PCR 引物。”通過一個寡核苷酸的連接，這些雙引物能捕獲目標序列的任意一端，形成一個側翼有缺口的分子半環(就像一個打開的鎖)。這個鎖可以由 DNA 聚合酶或連接酶閉合，這樣捕獲的材料就能擴增和測序，未捕獲的序列則被核酸外切酶破壞。

　　這一方法比簡單的聚合酶鏈式反應具有更多優勢：消除了多重性的麻煩。“你不會遇到在多重聚合酶鏈式反應中的N層問題。” Church 解釋道，“原則上每個引物都能與其他任何一個引物以及他們的延生產物進行相互作用。”

　　因此，大量的探針模塊能夠在單個反應中得到整合。2007 年， Church 和當時的博士后 Shendure 多路復用了 55000 個分子反向探針，能夠捕獲大約 10000 個外顯子。到了 2009 年， Shendure 對庫進行改良，目標為 50000 個外顯子。

　　如今， Shendure 則更傾向于使用 SeqCap EZ。但他也在使用分子反向探針。 2012 年 12 月，他和同事 Evan Eichler 使用分子反向探針從 2446 個患者樣本中捕獲了 44 個與自閉癥譜系障礙潛在相關的基因。波士頓一家新公司 Pathogenica(由 Church 共同創立)也在細菌菌株歸類和病毒藥物耐受分析中使用分子反向探針。

　　“當你想要在一大群人中對適度數量的基因進行測序時，鎖式方法是個絕佳的選擇。” Shendure 說。

　　安捷倫公司在其 HaloPlex 外顯子組試劑盒中對相關策略進行了商業化。在 HaloPlex 中，在任意端捕獲序列的長生物素標記寡聚物通過雜交捕獲目標基因組片段，通過產生能被聚合酶鏈式反應擴增的環，一步就完成測序文庫的構建。“這是兩個世界的結合。” Yi 說，“它結合了雜交的優勢與聚合酶鏈式反應的簡易性。”

　　臨床中的外顯子組

　　密爾沃基《哨兵日報》在 2011 年普利策獎特輯中完美地闡釋了外顯子組測序。報道中，一個小男孩患有嚴重的炎癥性腸病，隨后威斯康辛醫學院的一群研究者開始診斷并治療這個令人費解的特殊案例。這恰好是外顯子測序首次在臨床使用，研究人員在X連鎖凋亡抑制(X-linked inhibitor of apoptosis)基因中鑒定了一個單點突變。這一信息預示著一種治療策略的可能性——臍帶血移植。從那之后，該學院將這一方法應用到其他 25 個案例中，其中 27﹪得到了“明確的診斷”。

　　威斯康辛的研究者將 X 連鎖凋亡抑制病人的外顯子讀到了 34 倍。 Veltman 說他希望將他的臨床外顯子組測到 1000 倍覆蓋，但是成本和通量將他限制在60倍左右的覆蓋度，然而布羅德的 Gabriel 在癌癥基因組地圖(Cancer Genome Atlas，TCGA)計劃中收集的外顯子組達到 120 倍的覆蓋度。這比典型的全基因組深度更高( Gabriel 說，布羅德研究所測到 50 倍)，但在某些應用中，尤其是牽扯到病人時，即便做到 120 倍覆蓋也是不夠的。

　　Gabriel 舉例，眾所周知胰腺癌樣品難以獲得高純度，但它卻需要 300 到 400 倍的覆蓋度。對于其他應用，如在患者樣本中檢測特殊的致死突變，醫生“至少需要 500 倍的覆蓋。” Gabriel 說。

　　即使在外顯子組中，相對較少的基因突變實際上是可行的。但結合這一事實和覆蓋的深度，有些臨床研究人員開始思考縮小比例的方法。

　　“實際情況是對于每個臨床外顯子組，在目標基因篩選的設置中都能測出很多很多的(樣品)。”英國韋爾科姆基金會桑格研究所癌癥基因組計劃課題組長 Ultan McDermott 說，“要界定支持生物學結果的突變特征，如藥物反應和成活率，就需要做出比之前國際上(下一代測序)更多的測序，這幾乎是必然的。”

　　因此， McDermott 倡導使用大規模的外顯子測序計劃，如國際癌癥基因組共同體，鑒定有趣的突變，并鑒定 400 到 500 個基因的小規模目標基因測序以對病人進行實際的檢測。的確， McDermott 表示這一方法已在一項歐洲啟動的 SPECTAcolor 試驗性研究中開始實行，所有考慮進行臨床試驗的結腸直腸癌癥患者將有 400 個左右的基因在桑格研究所得到測序。“這一信息會立刻將病人分到任意一個臨床試驗中，在那里你需要了解某個具體的突變，并作為切入點。”

　　當然，另一方面在于目標明確的研究所固有的偏好性。“顯然，如果你還沒有明確目標的話，是什么都找不到的。” McDermott 說。

　　Veltman 的研究就是一個經典案例，他研究的是嚴重的智力缺陷。大約有 200 個基因與這一癥狀相關，他說，但是“很明顯，我們只掌握了其中的 10%”。因此，使用目標明確的方法只能尋找已知的遺傳基因，就有可能失去感興趣的東西。

　　在 2010 年一項研究中， Veltman 的團隊對 10 個“三人組”(一個患病小孩及其未患病的父母)進行了 42 倍覆蓋度的測序，最終聚焦于 10 個“新生”突變(在父母體內未出現損傷)。其中三個與智力缺陷相關聯，還有三個沒有相關性。對剩下四個的功能分析(例如，觀察行為和在模式生物中的相互作用同伴)表明，它們也可能在智力缺陷中起到一定作用。 2012 年的一項后續研究將同樣的策略用于 100 個患者，鑒定出了 10 個已知與智力缺陷關聯的基因和 19 個潛在基因的新生突變，并且證實了三個新遺傳基因(其中一個來自于 2010 年研究中的四個基因)。

　　Veltman 說，在這兩項研究中新生突變的患病率全然不顧傳統觀點中嚴重智力缺陷的偶發性，傳統觀點通常將病癥歸因于常染色體隱性遺傳。同時，遺傳學家需要從根本上重新評定他們對罕見疾病的理解。“事實證明，這些新生突變是造成智力缺陷的一項普遍原因。” Veltman 說。

　　然而，如果使用簡單的基因模塊其中很多基因就可能會被錯過，因為它們不屬于當時已知的嚴重智力缺陷相關的基因。

　　當然，還有更多的基因可以經過全基因組分析得到，(像其他人一樣) Veltman 也在追蹤這條線索。大多數研究人員同意，一旦全基因組的測序、分析的成本和容易程度可以趕上外顯子組，外顯子組測序的吸引力將會消退。

　　但是如果沒有其他替代物的話，這種魅力是不會消失的，大量患者群體研究很可能會需要外顯子組測序。 Shendure 說，“你應該理性地做研究，盡量將你感興趣的問題理順。有時是基因組的問題，有時又會是外顯子組，而有時這個問題又會更有針對性。”