ScienceAdvances:掃描新技術探討新冠病毒蛋白生物物理約束

提高SARS-CoV-2刺突蛋白(spike, S)的表達水平對于COVID-19疫苗的研發至關重要。之前的研究主要集中在設計受體結合結構域(RBD)和S2亞基，而氨基末端結構域(NTD)由于對其生物物理約束的理解有限而長期被忽視。2022 年11月23日，伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校Nicholas C.Wu團隊歐陽文浩、Timothy J.C.Tan等在SCIENCE ADVANCES期刊上發表了"Probing the biophysical constraints of SARS-CoV-2 spike N-terminal domain using deep mutational scanning" 研究文章，通過深度突變掃描定量分析了數千個NTD單突變對S蛋白表達的影響。結果表明，在S蛋白表達方面，NTD殘基的突變耐受性與它們與RBD和S2的接近程度呈負相關。作者還發現結構域間界面的NTD突變增加了S蛋白的表達，但不改變其抗原性。這項研究不僅促進了對NTD生物物理限制的理解，而且為基于S蛋白的免疫原設計提供了寶貴的見解。

1 介紹

SARS-CoV-2的刺突蛋白(spike, S)在病毒侵入細胞時發揮了關鍵作用。S蛋白由S1亞基和S2亞基組成，S2亞基位于S蛋白C端，介導病毒-宿主膜的融合，S１亞基包含N端結構域（NTD）和受體結合域（RBD），RBD是與宿主受體血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合的關鍵區域，公認具有免疫優勢，有研究表明NTD也是中和抗體的靶點，在免疫應答過程中發揮重要作用。結構研究表明，NTD上存在一個經常在SARS-CoV-2高關注變異株(VOCs)中發生突變的抗原超位點。在人類SARS-CoV-2進化過程中，氨基酸突變和插入缺失在NTD內迅速累積，至少部分原因是其免疫選擇壓力。另一方面，針對高關注變異株(VOCs)中保守的NTD表位的抗體也被發現。盡管NTD在對抗SARS-CoV-2的免疫應答中發揮重要作用，但對NTD的生物物理學約束在很大程度上仍不清楚。

COVID-19疫苗(包括基于重組蛋白和基于mRNA的疫苗)已被證明對SARS-CoV-2感染具有高度保護作用。高蛋白表達水平也被認為是mRNA疫苗有效性的關鍵。因此，識別增加S蛋白表達的突變對于優化COVID-19疫苗至關重要。目前大多數研究集中在突變S2亞單位和RBD以增加S蛋白的表達，由于對NTD的生物物理特性缺乏了解，很少有研究花費在NTD上。

通過深度突變掃描(將飽和突變和二代測序相結合)，可以大規模并行地測量許多突變的表型。之前的研究應用深度突變掃描來評估RBD突變對蛋白表達、ACE2結合親和力和抗體逃逸的影響。雖然對RBD的深度突變掃描提供了關于免疫原設計和SARS-CoV-2進化的重要見解，但尚未開展關于S蛋白其他區域的類似研究。

在本研究中，作者使用深度突變掃描來量化數千個NTD單突變對S蛋白表達的影響。一個值得注意的觀察是，與RBD殘基不同，NTD殘基顯示出突變耐受性和相對溶劑可及性(RSA)之間的弱相關性。NTD殘基的突變耐受性與它們與RBD和S2的距離強相關。殘基S50和G232是兩個例外，它們分別位于S2和RBD的近端，但具有較高的突變耐受性。并進一步對增加S蛋白表達的兩個突變S50Q和G232E進行了功能特征分析。這些結果對理解NTD進化和基于S蛋白的免疫原設計具有重要意義。

2 結果

2.1 大多數NTD突變對S蛋白表達影響很小

為了研究NTD突變對SARS-CoV-2 S蛋白表達的影響，作者創建了一個突變體文庫，其中包含了S蛋白第14 ~ 301位殘基上所有可能的單氨基酸突變。在這288個氨基酸殘基中，每一個殘基都發生了突變，導致了一個包含5760個單氨基酸突變的突變文庫。構建突變文庫后，選取10個菌落進行Sanger測序作為質量控制。所有突變均為單一突變。

2.2 突變耐受性與溶劑可及性的相關性很小

首先，研究了突變耐受性與RSA之間是否存在相關性。由于埋藏殘基對蛋白質折疊穩定性通常很重要，因此RSA較低的殘基通常具有較低的突變耐受性。相反，NTD殘基的突變耐受性與RSA的相關性較弱。這些觀察表明，NTD的折疊穩定性對其突變耐受性和S蛋白表達水平沒有強烈的影響。另一種可能是一些突變可以使NTD不穩定，但NTD不穩定并不影響S蛋白的表達水平。

2.3 突變耐受性與RBD/S2的距離相關

作者進一步計算了每個NTD殘基到S蛋白RBD/S2的距離。突變耐受性與距離RBD/S2的距離呈正相關。NTD殘基與RBD/S2的距離越遠，突變耐受性越高。

2.4 自然循環的NTD插入缺失位點具有顯著較高的突變耐受性

作者利用深度突變掃描數據分析了在17種SARS-CoV-2主要變異株中觀察到的自然發生的NTD突變和插入缺失。

2.5 兩個埋藏的NTD突變增加了S蛋白的表達

雖然毗鄰RBD/S2的NTD殘基通常具有較低的突變耐受性，但S50和G232是兩個例外。例如，在作者的深度突變掃描結果中，突變S50G和G232E具有高表達評分。為了驗證這一發現，使用相同的 landing pad 系統構建了穩定表達S50Q、G232E和S50Q/G232E雙突變的HEK293T細胞株。通過流式細胞儀分析，與野生型(WT)相比，S50Q和G232E的平均熒光強度(MFI)分別增加了1.7倍(P = 0.002)和1.5倍(P = 9 × 10^?4)，而S50Q/G232E增加了2.5倍(P = 2 × 10^?6)。雖然MFI的倍數變化不太可能與蛋白質合成的倍數變化呈線性相關，但這種MFI的增加表明S50Q, G232E，以及S50Q/G232E雙突變體相比WT的表面表達增加。

隨后，作者研究了S50Q和G232E突變的自然發生情況。S50Q和S232E在流行的SARS-CoV-2中很少出現。在全球共享禽流感數據倡議(GISAID)的1000多萬條NTD序列中，分別只有22條和3條序列包含S50Q和G232E。為了探究S50Q和G232E的結構影響，分析了它們的局部環境對S蛋白結構的影響，并使用Rosetta進行了結構建模。作者進一步重組表達了這些突變體，并使用熱位移分析測試了它們的熱穩定性。所有重組表達的S蛋白均含有S2亞單位的K986P/V987P突變，已知這些突變可穩定融合前構象并增加表達。WT和NTD突變體的變性溫度幾乎相同，Tm為46℃到46.5℃。這些觀察表明，盡管S50Q和G232E都改善了NTD和S蛋白其余部分之間的相互作用，但它們對S蛋白的整體折疊穩定性影響很小。與野生型相比，所有突變體均提高了可溶性重組表達的S蛋白的產量。

2.6 S50Q和G232E對融合活性和抗原性影響較小

為了了解S50Q和G232E的功能結果，進一步測試與WT的比較，S50Q、G232E和S50Q/G232E是否表現出融合活性的變化。作者將表達人ACE2 (hACE2)和mNG2_1-10的HEK293T landing pad 細胞與表達S蛋白和mNG2₁₁的HEK293T landing pad 細胞混合。研究結果表明，S50Q和G232E均未影響S蛋白的融合能力。

然后，作者進一步研究S50Q、G232E和S50Q/G232E是否會改變S蛋白的抗原性。檢測針對S蛋白不同結構域的3種抗體CC12.3(抗RBD)、S2M28(抗NTD)和COVA1-07(抗S2)的結合情況。其中，S2M28是一種NTD超位點靶向抗體。流式細胞儀分析表明，所有三種抗體均以與WT相似的水平與檢測的突變體相結合，這表明S50Q、G232E和S50Q/G232E未改變S蛋白的結構構象和抗原性。

3 討論

S蛋白是SARS-CoV-2進化和COVID-19疫苗研究的核心。雖然S蛋白上的RBD和NTD都是中和抗體的靶點，并且參與了SARS-CoV-2的抗原漂移，但NTD通常不像RBD那樣受到關注。利用深度突變掃描，本研究表明許多NTD埋藏殘基的突變并不影響S蛋白的表達。同時，NTD突變與RBD/S2越接近，越有可能損害S蛋白的表達。這些觀察結果表明，對于最佳的S蛋白表達，NTD- RBD和NTD-S2界面的結構穩定性比NTD的折疊穩定性更關鍵。總之，這項研究為NTD的演變提供了至關重要的生物物理學見解。

NTD突變S50Q和G232E位于結構域間界面，增加了S蛋白的表達，這是本研究的另一個重要發現。改造高表達的S蛋白可以降低重組COVID-19疫苗的生產成本，并可能提高mRNA疫苗的有效性。與S2的某些先前特征突變相似，NTD中的S50Q和G232E在不改變Tm的情況下增加了S蛋白的表達量。同樣，最近的一項研究表明，BA.1的NTD突變改善了S蛋白的表達，卻不增加其熱穩定性。此外，S50Q和G232E沒有暴露在S蛋白表面，似乎沒有改變S蛋白的抗原性。值得注意的是，根據作者的深度突變掃描數據，S50Q和G232E只是增強S蛋白表達的眾多突變中的兩個。因此，盡管大多數基于S蛋白免疫原設計的研究關注于RBD和S2的突變，但此研究的結果表明，NTD的突變可以提供一種互補的策略。

參考資料：

1. Ouyang WO*, Tan TJC*, Lei R, Song G, Kieffer C, Andrabi R, Matreyek KA, Wu NC. Probing the biophysical constraints of SARS-CoV-2 spike N-terminal domain using deep mutational scanning. Science Advances 8:eadd7221 (2022)