真空轉移法的最大優點是迅速，可在轉膜的同時進行DNA變性與中和整個過程約需30～60分鐘。但在操作中應注意兩個問題，一是真空壓力不能太大，若壓力過大，凝膠被壓縮，轉移效率會降低；二是真空轉移液要密封嚴，防止漏氣影響壓力的產生。下表列出了不同的印跡方法。
表10－2 不同印跡方法的比較表
五、探針標記
用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質標記或用地高辛標記，放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4
多聚核苷酸激酶進行末端標記。探針標記的方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，詳細方法參見本書相關章節。
這里介紹放射標記。以下為 Promega公司隨機引物試劑盒提供的標記步驟：
（一） 取25～50mg模板DNA于0.5ml離心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二） 在另一個0.5ml離心管中加入：
Labeling 5×Buffer (含隨機引物) 10μl
dNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μl
BSA(小牛血清蛋白) 2μl
[α-32ρ] dATP 3μl
Klenow 酶 5U
（三） 將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混勻。室溫或37℃ 1h.
（四） 加50μl終止緩沖液終止反應
標記后的探針可直接使用或過柱純化后使用。由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以標記好的探針應盡快使用。探針的比活性最好大于 1091計數/分/μl。
六、預雜交（prehybridizafion）
將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交之前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能結合DNA片段的膜同樣能夠結合探針DNA，在進行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉，這就是預雜交的目的。預雜交是將轉印后的濾膜置于一個浸泡在水浴搖床的封閉塑料袋中進行，袋中裝有預雜交液，使預雜交液不斷在膜上流動。預雜交液實際上就是不含探針的雜交液，可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。但其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針DNA雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點。
具體步驟如下：
（一） 配制預雜交液
6XSSC
5XDenhardt’s試劑
0.5%SDS
50%(v/v)甲酰胺
ddH2O
100 ug/ml鮭魚精DNA變性后加入
注：1. 每平方硝酸纖維素膜需預雜交液0.2ml。2. 預雜交液制備時可用或不用poly(A)RNA。3.
當使用32P標記的Cdna作探針時，可以在預雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結合。4.
按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度（Thyb）。（如果使用標準雜交液，靶序列DNA GC含量為40%，則Thyb為42℃。）
（二） 把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。
（三） 將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10m l2×SSC浸濕濾膜。
（四） 將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
（五） 從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。
（六） 加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。
（七） 盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.
七、 Southern雜交
（一） 原理
轉印后的濾膜在預雜交液中溫育4-6h，即可加入標記的探針DNA（探針DNA預先經加熱變性成為單鏈DAN分子），即可進行雜交反應。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行。雜交過夜，然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高，雜交的嚴格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結合。
（二） 步驟
1. 將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
2. 從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預雜交液中。
3. 盡可能除取袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內。
5. 置42℃水浴溫育過夜（至少18h）。
八、 洗膜
取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗 5min，然后按照下列條件洗膜：
2×SSC/0.1%SDS， 42℃，10min
1S×SCC/0.1%SDS， 42℃，10min
0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min
0.2×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min
0.1×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min
采用核素標記的探針或發光劑標記的探針進行雜交還需注意的關鍵一步就是洗膜。在洗膜過程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。
九、放射性自顯影檢測
（一） 將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。
（二） 在暗室內，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒。
（三） 將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。
（四） 從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時間，再洗第二張片子）。
（注：注意同位素的安全使用）
實驗結果及注意事項
在膜上陽性反應呈帶狀。實驗中應注意以下問題：轉膜必需充分，要保證DNA已轉到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結果和背景反差對比好的關鍵。洗膜不充分會導致背景太深，洗膜過度又可能導致假陰性
若用到有毒物質，必需注意環保及安全。