【原理】
Southern雜交是分子生物學的經典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上,與標記的核酸探針進行雜交,在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。
一．基因組DNA的限制酶切
【操作】
DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性內切酶(lOU /μl)
5.0μl、加ddH2O至50μl,在最適溫度下消化1～3h。消化結束時可取5μl電泳檢測消化效果。如果消化效果不好,可以延長消化時間,但超過6h己沒有必要。或者放大反應體積,或者補充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質,或酶的活力下降。消化后的DNA
加入1/10體積的0.5mol/L
EDTA,以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提,2.5倍體積乙醇沉淀,少量TE溶解(參見DNA提取方法,但離心轉速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丟失)。如果需要兩種酶消化DNA,而兩種酶的反應條件可以一致,則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致,則先用需要低離子強度的酶消化,然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度,再加第二種酶進行消化。
二．基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳
【操作】
1.制備0.8%凝膠一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。
2.
電泳電泳樣品中加人6×Loading緩沖液,混勻后上樣,留一或兩泳道加DNAMarker。1～2V/cm,DNA從負極泳向正極。電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時,停止電泳。取出凝膠,紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺,拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的涂抹帶,照片攝人刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置,以確定被雜交的DNA長度。
三．DNA從瓊脂糖凝膠轉移到固相支持物
【操作】
1.堿變性 室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中30min。
2.中和 將凝膠轉移到中和液15min。
3.轉移 按凝膠的大小剪裁 NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記,水浸濕后,浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman
3mm濾紙作為鹽橋,再按凝膠的尺寸剪3～5
張濾紙和大量的紙巾備用。按圖8-9所示進行轉移。(轉移過程一般需要8～24h,每隔數小時換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。)
4.轉移結束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液數分鐘,洗去膜上沾染的凝膠顆粒,置于兩張濾紙之間，80℃烘2h,然后將NC膜夾在兩層濾紙間,保存于干燥處。
四.探針標記
【操作】
（隨機引物試劑盒提供的標記步驟）
1. 取25～5Ong模板DNA于0.5ml離心管中,100℃變性5min,立即置冰浴。
2. 在另一個0.5時離心管中加入:Labeling5×buffer 10μl(含有隨機引物)，dNTPmix2μl(含dCTP、
dGTP、dTTP各 0.5mmol/L)，BSA(小牛血清白蛋白)2ul， [α-32p]dATP 3μl，Klenow 酶 5U。
3. 將變性模板DNA 加入到上管中,加雙蒸水至50μl,混勻。室溫或37℃1h。
4. 加50μl終止緩沖液終止反應。標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于α-32P的半衰期只有14天,以標記好的探針應盡快使用。探針的比活性最好大于109計數/分/μl。
五．雜交
【操作】
1. 預雜交
NC膜浸入2×SSC液中5min,在雜交瓶中加入雜交液(8cm×8cm的膜加5ml即可),根膜的背面貼緊雜交瓶壁,正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中,使雜交體系升到42℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA
(已溶解在水或TE中)100℃加熱變性5min,迅速加到雜交瓶中,使其濃度達到100ug/ml。雜交4h。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點,降低雜交背景、提高雜交特異性。
2．雜交 倒出預雜交的雜交液,換上等量新的已升溫至42℃的雜交液,同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min,使其變性,迅速加到雜交瓶中。42℃ 雜交過夜。
六．洗膜與檢測
【操作】
取出NC膜,在2×SSC溶液中漂洗5min,然后按照下列條件洗膜
2× SSC/0.1% SDS, 42℃, l0min
1× SSC/0.1% SDS, 42℃, l0min
0. 5×SSC/0.1% SDS, 42℃, 10min
0.2×SSC/0.1% SDS, 56℃, 10min
0.1×SSC/0.1% SDS, 56℃, 10min
在洗膜的過程中,不斷振搖,不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明,當放射強度指示數值較環境背景高1～2倍時,是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點,都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC液中2min,取出膜,用濾紙吸干膜表面的水分,并用保鮮膜包裹,注意保鮮膜與
NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上,放入暗盒中(加雙側增感屏),在暗室的紅光下,貼覆兩張X線片,每一片都用透明膠帶固定,合上暗盒,置-70℃低溫冰箱中曝光。根據信號強弱決定曝光時間,一般在1-3天時間。洗片時,先洗一張X線片,若感光偏弱,則再多加兩天曝光時間,再洗第二張片子。影響
Southern雜交實驗的因素很多,主要有:DNA純度、酶切效率、電泳分離效果轉移效率、探針比活性和洗膜終止點等。