1）取10ul待測DNA，于一定濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。(20mL,1.0%凝膠,)
2) 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號, 拍照記錄電泳結果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。
3) 雜交用膠的制備 (做以下步驟兩組合一)
A.將凝膠浸沒入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
B.用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
C.將凝膠浸沒入30mL變性液中30min, 使凝膠變性。
D.將凝膠浸沒入30mL中和液中15min使它被中和。
重復D一次。在制備雜交用膠時準備轉移的平臺、膜、濾紙等(4、5)。
4) 準備DNA從凝膠向膜轉移的平臺
5) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標記。
另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約18cm)足以達到轉移液盒子的底部。
準備10 X SSC 轉移液。
將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉移液中。
6）安裝毛細管轉移裝置
A.將長的濾紙放在轉移平臺的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。
B.將8 0mL轉移液倒入轉移盒內，并濕潤濾紙。
C.將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
D.用保鮮紙封住凝膠四邊。
E.將浸濕的轉移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
F.將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物。
G.轉移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉移液干枯。
7)已轉移的DNA與膜交聯
A.將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
B.將膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自動交聯。
C.用蒸餾水短暫的漂洗已交聯的膜，空氣中干燥。
此膜可在4℃長期保存。
8)DNA探針的制備(略過)
參照生產商提供的實驗方法合成地高辛標記的探針。
9）印跡的預雜交
將適量的預雜交液DIG Easy Hyb在42 oC預熱。
放入印跡膜,在42℃預雜交30min。
10)準備探針
水煮地高辛標記的探針5min使變性, 并立即放在冰上2min.
11) 加適量的探針到已預熱的雜交液中,混合均勻(避免形成泡沫,影響雜交效果)。42℃雜交至少4小時或過夜。
注意: 不要將探針直接加在印跡膜上，而應加在容器一角的預雜交液中
12）印跡膜的沖洗：
A.將雜交液倒出，儲存起來可再次使用。
B.用 25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室溫搖動洗膜2次,每次5min .
C.用已預熱的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65℃搖動洗膜2次,每次15min (用雜交爐).
13)免疫檢測:
A.用10mL沖洗液洗膜1-5min.
B.膜在15mL阻斷液中孵育30min
C.膜和8mL抗體孵育30min
D.在15mL沖洗液中洗膜2次,每次15min.
E.在15mL檢測液中平衡2-5min.
14)將膜的有DNA的面朝上,放在保鮮紙上,滴數滴 CSPD ready-to-use 覆蓋膜; 然后,立即用保鮮紙包裹, 擠掉多余的CSPD ready-to-use,使其均勻平鋪在膜上,沒有氣泡, 但避 免使膜干掉. 室溫孵育5min.
15)在37℃孵育潮濕的膜10min,增強發光.
16)用X-光底片將雜交膜進行曝光10-25min.
(發光性能至少可持續48小時)
17) X-光底片的沖洗。
Agfa 30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾干底片。