T克隆綠色熒光蛋白（GFP）基因實驗

【原理】

經TaqDNA聚合酶擴增后的PCR產物末端都帶有單個A。正是基于這一原理，pGEM-T質粒經EcoRV切成平端后，在開口端加上一個T制成T載體，一方面避免了自身環化，另一方面由于T-A互補，從而提高了T載體與PCR產物之間的連接效率。由于T-A克隆只需純化PCR產物，因而操作較為簡便。

pGEM-Tvector含絲狀噬菌體f1的復制起始區，用于產生環狀ssDNA；含有T7和SP6RNA聚合酶啟動子；在多克隆區域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通過藍、白菌落直接篩選重組菌落。

轉化是將外源DNA分子導入到受體細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉化所用的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶（R-，M-）。將對數生長期的細菌（受體細胞）經理化方法處理后，細胞膜、的通透性發生暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞。進入受體細胞的DNA分子通過復制和表達實現信息的轉移，使受體細胞具有了新的遺傳性狀。將經過轉化的細胞在篩選培養基上培養，即可篩選出轉化子（帶有異源DNA分子的細胞）。

實驗采用CaCl2法制備感受態細胞。其原理是細胞處于0～4℃，CaCl2低滲溶液中，大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃90秒熱激處理，促進細胞吸收DNA得合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥（Ampr）得到表達，然后將此細菌培養物涂在含Amp的選擇性培養基上，倒置培養過夜，即可獲得細菌菌落。

pGEM-TVector圖譜:
pGEM-T多克隆位點的序列：
【試劑與器材】

1.綠色熒光蛋白基因PCR產物，濃度為5ng/μl。

2.T4連接酶（購買Taq酶有配套的10×buffer）。

3.10×buffer濃度（購買T4連接酶有配套的Buffer）:

（66mmol/LMgCl，660mmol/LTris-Cl(pH7.6)，100mMDTT，1mMATP）。

4.消毒三蒸水
5.LB液體培養基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高壓滅菌消毒。

6.LB固體培養基LB液體培養基中加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手背時鋪培養皿。

7.0.1mol/LCaCl2高壓滅菌消毒或過濾除菌。

8.氨芐青霉素用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

9.大腸桿菌DH5α此為DNA擴增菌。

10.超凈工作臺

11.高速冷凍離心機

12.恒溫搖床

13.恒溫箱

14.恒溫水浴箱

15.消毒離心管

16.消毒tips

17.玻璃培養皿直徑90mm

18.玻璃涂布器和95%乙醇

19.標記筆

20.各種國產或進口移液器(10，20，100μl)

21.消毒的0.2mlPCR管。

【操作步驟】

1.細菌感受態細胞的制備

將DH5α和BL21（DE3）菌種分別劃線于LB瓊脂板上，37℃培養過夜。挑取單菌落接種于5mlLB培養基中，37℃振蕩培養培養過夜。次日取菌液1ml接種至含有100mlLB培養基的燒瓶中，37℃劇烈振蕩培養至約2～3h，待A600值達到0.3～0.4時將燒瓶置于冰浴10～15min。將細菌轉移到一個滅菌處理過的冰預冷的50ml離心管中。4000×g，4℃離心10min，棄培養基，將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。加預冷的已過濾除菌的0.1mol/LCaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4000×g，4℃離心10min，棄培養基。再加4ml預冷的0.1mol/LCaCl2，輕輕重懸菌體，置4℃冰箱12～16h。

2.PCR產物與T載體連接

在0.2ml或0.5ml反應管中加入下列成分:

pGEM-T50ng

純化的PCR產物10-50ng

T4連接酶2-3weissunits

10×連接緩沖液1μl

補超純水至總體積為10μl，常溫下放置30分鐘以上；也可以16℃或4℃過夜。

3.重組子的轉化

在無菌條件下按每管取100μl新鮮感受態細菌置于無菌的1.5ml塑料離心管中，共2管，分別加入連接產物和消毒水(作陰性對照)各5μl，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min。42℃，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800μl無抗生素的LB培養基，于37℃空氣搖床中以150r/min速度振搖45min，使細菌復蘇。每管取200μl加至含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻，室溫放置20min，使液體吸收，然后37℃倒置培養12～16h至單菌落形成。