基 本 方 案 1 未 致 敏 T 淋巴細胞的活化材 料
備選方案1 用抗體激活未致敏的T 細胞這種方法適用于當抗C D 3/T C R 復合物抗體不能有效結合小鼠輔助細胞上的F c 受體 ，或其可溶形式不能有效活化T 細胞時。值得注 意 的 是 ，在 某 種 抗 體（如 抗 G 7、Thy-I 單克隆抗體）很難誘導T 細胞增殖反應的情況下，推薦采用基本方案1。 附 加 材 料P B S (室溫和 4°C ) 用 P B S 配 制 lm g /m l 純化的抗C D 3 或 抗 T C R 單 克 隆 抗 體（非特異性活化T 細胞)或 lmg/m l 純 化 的 抗 V 卩或抗T C R -y S 單 克 隆 抗 體（特 異 性 激 活 T 細胞 ，表
2.11.1) 1.在 4 ml聚苯乙烯圓錐底離心管中，用 無 菌 室 溫 PBS (不含蛋白質）將 lmg/ml無菌的 單 克 隆 抗 體 儲 存 液（表 2.11.1)，根 據 實 驗 需 要 配 制 4 個 濃 度 的 工 作 液 ：如lOOug/ml、 10ug/ml、 1ug/ml、 O.lug/ml， 臨用前配制。 2 .加 30ul各濃度的抗體工作液（每孔最多結合2?3 ug ; 最佳濃度通常為10ug/ml) 至9 6 孔 圓 底 板 中（每種單抗使用一行），用 30/xl P B S 作為對照孔。 3 . 蓋好板蓋，輕拍培養板側面確保液體完全覆蓋孔底。 37°C 培 養 90 min，或 者 4°C 培養過夜。培養的同時進行下一步操作。 4 . 同基本方案1 中的步驟1?3 , 制 備 反 應 細 胞 懸 液（可高度純化，但其中的輔助細胞并不影響實驗結果）。 5 . 每孔加 入 200ul預 冷 的 P B S 洗滌上述抗體包被的培養板孔，在超凈臺中將培養板反轉倒扣于吸水紙上輕拍，除去殘余的液體，重 復 洗 滌 2 或 3 次 ，確保除去多余的抗體。 6 . 在洗好的板中加入準備好的細胞懸液2 X 105 個細胞/ (0.2 ml ?孔）（根據經驗來確定 ，不能用雜交瘤上清）。如果細胞暫時未準備好，可 加 100M P B S 后 置 4°C 保存過夜（加細胞前應去掉P B S )。 7 . 按基本方案1 中的步驟7?9 進 行 ，在 培 養 2?3d 后（進行動力學實驗確定最佳時間）加入3H TdR。 備選方案 2 混合淋巴細胞增殖實驗附 加 材 料
輔助方案1 從抗原呈遞細胞或刺激細胞懸液中剔除T 淋巴細胞這一方法的主要目的是排除輔助T 細胞的影響。純化和富集抗原呈遞細胞的方法見相關章節；單 元 2. 3 中介紹的方法未剔除T 細胞，因此不推薦使用。 附 加 材 料（其 他 材料 見 基 本 方案 1）與反 應 T 細胞同基因的未免疫小鼠脾細胞 H B S S 低 毒 兔 補 體（Cedarlane) ，用冰冷無菌的去離子水稀釋 抗 Thy-l.2單 抗（H 〇 -13-4， A T C C n o . TIB9 9 ) 或 抗 T h y-l.l 單 抗（H 〇 -22-l ，A T C C n o . TIB1 0 0 ; 或其他抗-Thy-I 單 克 隆 抗 體 見 C P I M 表 3. 4. 1 和腹水制
輔助方案2 輔助/刺激細胞的滅活注 ：當 需 要 檢 測 基 因 編 碼 的 抗 原 性 差 異 或 沒 有 輻 射 射 源 時 ，多數研究者優先采用絲裂霉素 C 滅活細胞。 絲裂霉素C 滅活細胞 附 加 材 料
細胞維持抗原呈遞功能； 1100?2000rad輻射后，抗原呈遞能力大幅度下降；> 2 0 0 0 m d滅 活 的 B 細胞失去 A P C 功能。而另一方面，巨噬細胞和樹突細胞在 3000rad 照射后依然保持抗原呈遞的功能。為 確 保 B 細胞不參與應答，一些研究者傾向于采用 2000rad。然而，在檢測刺激細胞 M l s 位點抗原時，應采用< 1000m d 的輻射，因 為 此 時 B 細胞能夠更為有效地呈遞 M l s 抗原。另外 ， M l s 應答也可在絲裂霉素C 處理后進行檢測，處理 后 的 B 細胞依然保持抗原呈遞的功能。 在轉化的細胞株用作抗原呈遞或輔助細胞時，需使用高強度的照射從而阻斷其增殖 。每種細胞株適合的輻射強度需要根據預實驗來確定，但 至 少 應 達 5000rad; 某些轉化的細胞株可能需要高達 10 〇〇〇?20 OOOrad，或 有 些 細 胞 株 可 能 對 絲 裂 霉 素 C 更為敏感。 基本方案2 致敏T 細胞的活化材 料
在 第 4 天 或 第 5 天達到髙峰）。 基本方案 3 C D 4+C D 25+T 細胞的活化和抑制功能的檢測材 料
備選方案 3 C D 4+C D 25+T 細胞抑制功能的兩步法檢測：短期活化和擴增C D 4+C D 25+T 細胞并分析其抑制功能 附 加 材 料
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