基 本 方 案 間 接 淘 洗 法 分 離 T 細胞亞群材 料親和純化的人免疫球蛋白吸附的羊抗鼠 Ig (Tago) 0.05m ol/L Tris ?Cl，pH9. 5 抗 CD 8 抗體或其他特異性小鼠抗體（多克隆或單克隆；如 Coulter 或 Becton Dickinson) PBS 總 T 細 胞（見輔助方案 1 或 2) 含 5 % 和 1 % (V A O 熱滅活 FCS (56°C ， Ih) 的 PBS R PM I 完 全 培 養 基（無血清，經過濾保持無菌） 15 mmX IOOmm 塑料培養皿，細 菌 學 級 別（非組織培養用） 15m l 離心管 Beckman GPR GH-3. 7 水 平 轉 頭 離 心 機（或者其他同類產品）， 4?10°C 4°C 的臺式搖床 倒置顯微鏡 無菌細胞刮 1.用 pH9. 5 的 0?05m ol/L Tris ? Cl 稀釋羊抗鼠 Ig 至 10 ug/ml， 取 IOml 加入 15 mmXIOOmm 培養皿，輕輕晃動使之覆蓋平皿底面，室 溫 孵 育 40 min， 或 者 4 °C 孵 育 24 h。 備 選 方 案 抗 體 依 賴 補 體 介 導 的 細 胞 毒 作 用 分 離 T 細胞亞群T 細胞中某一亞群可以通過與特定抗體結合而被去除，本 方 案 使 用 的 是 抗 C D 4抗體。 附 加 材 料新 生 家 兔 補 體（Cedarlane 實驗室），禁止反復凍融 R P M I -I 完全培養基 抗 C D 4 抗體或者其他特異性小鼠抗體（多克隆或單克隆抗體；必須是補體結合的IgG2a 或 I g M ; 如 Coulter 或 Becton Dickinson) 1.檢測新生家兔補體對人單個核細胞非特異毒性的情況。確定能夠產生最大抗體介導的細胞毒性和最小非特異細胞毒性（如不加入特異性抗體時細胞溶解）所需的補僅的 濃 度（通 常 為 2 0 % ?5 0 % ) 。 2.確定標記單個核細胞所需抗體量，用于流式細胞儀檢測。
3.將 IO6?IO7 個 T 細胞加入離心管， 18?20°C ， 400 g 離 心 lOmin。 棄上清，重懸細胞
輔 助 方 案 1 應用神經氨酸酶處理的綿羊紅細胞玫瑰花環形成法分離 T 細胞材 料懸 于 Alsever 溶液中的綿羊紅細胞（S R B C ; Colorado Serum) H B S S l U / m l 神 經 氨 酸 酶（低壓凍干的粉末， X 型 ； Sigma) 溶 于 PBS (附 錄 I); I m l 分裝保存于一 20°C R P M I -10 完全培養基 溶 于 R P M I -10 完全培養基中的 P B M C (I X IO7 個細胞/m l ; 單 元 8.1 ) 胎 牛 血 清（F C S ; 56°C 熱 滅 活 Ih) 聚蔗糖-泛影葡胺溶液 A C K 裂 解 液（可選用） Beckman G P R G H -3. 7 水 平 轉 頭 離 心 機（或者其他同類設備） 15m l 和 50m l 圓 錐 底的離心管（如 Falcon) 15m l 圓 底 離 心 管（如 Falcon) 1.在 50m l 離心管中加入 15?25m l 懸 浮 于 Alsever 溶 液 中 的 綿 羊 紅 細 胞（S R B C )，再加 滿 H B S S ， 18?20°C ， IOOOg 離 心 10 min。棄 上 清 ，用 H B S S 重 懸 細 胞 ，再次離
心 ，并重復洗一次。保存洗過的 S R B C 2?3d 。 2 . 將 Iml S R B C 混懸液加入 50m l 離心管，并 加 入 I m l 溶 于 P B S 的 l U /m l 神經氨酸酶，用移液管吹勻細胞， 37°C 水 浴 孵 育 lh。 3.加滿 H B S S ，用上述方法離心，棄上清，重 復 洗 2 次 。加 入 49 ml R P M I -10 完全培養基 重 懸 細 胞（S R B C 終濃度為 2 % ， V /V )。 4°C 保 存 直 至 使 用（5?7d)。 4.將<≤2 X 107P B M C 加 入 15m l 圓底離心管， 18?20°C ， 400 g 離 心 10 min。棄 上 清 ，R P M I -10 重懸細胞使其濃度為 I X IO7 個細胞/m l 。 5 . 每 I X I O 7 個細胞/ml P B M C 加 入 2m l 熱滅活的 F C S 和 2m l 神經氨酸酶處理過的 S R -B C ， 37°C 水 浴 孵 育 lh。 4°C ， 200 g 離 心 5 min。冰上孵育 Ih(無需棄上清）。
展開 | 
