實驗概要
本實驗對水稻、擬南芥及楊樹的TLP基因表達模式進行了分析，為進一步研明植物中TLP基因的功能奠定基礎。
實驗步驟
1. 水稻TLP基因的RT-PCR分析
1) 植物材料
選取水稻的根、莖、葉、花和種子的新鮮組織用于RNA的提取。水稻材料采集后，用液氮速凍，以保證RNA不被降解，然后凍存于-70℃超低溫冰箱，以備提取組織RNA時使用。
2) 植物組織提取RNA
試劑和器皿：所有試劑都用DEPC水配置，所有器皿都在180℃烘8hr或者在雙氧水中泡0.5hr以上。
試劑：RNA抽提緩沖液：0.2mo1/L Tris-Cl (pH=0.8)，0.4mo1/L LiC1，25mmol/LEDTA，1% SDS；3mol/L NaAc (pH=5.2)；2mol/L LiCl；RNase free的水飽和酚；氯仿；無水乙醇；70%乙醇；Dnase(RNase free)等。
步驟：新鮮的植物組織適量放置于盛有液氮的研缽中，保持低溫環境，用小磨棒研磨成粉，裝入1.5mL的離心管中，再加入40uL RNA抽提緩沖液和40uL酚，置于冰上。劇烈震蕩5次。13200rpm離心6min，取上清，移入另一裝有300uL氯仿的1.5mL離心管中，劇烈震蕩。13200rpm離心6min，取上清，移入另一裝有1000uL無水乙醇和40uL 3mol/L NaAc的1.5mL離心管中，-20℃放置20min以上。13200rpm離心10min，棄上清。70%乙醇洗一次，13200rpm離心5min，棄上清，超凈臺吹干。加入10-30uL DEPC水。-20℃短期保存，-70℃長期存放。
3) 引物設計
由于TLP基因家族成員間含有一些高度保守的序列，我們通過BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)的方法，避免TUB和F-box結構域或者其他一些高度同源序列被用于引物設計，以確保每對引物特異擴增所需的序列。引物序列略。
4) 反轉錄和PCR
a. 總RNA變性解鏈：總RNA 3.0uL；Oligo (dT) 5.5uL；DEPC處理的水3.5uL；70℃溫浴5min后，立即放入冰浴。
b. 逆轉錄前處理：M-Muly 5XBuffer 5.0uL；dNTP 5.0uL；RNasin 0.5uL(25units)；DEPC處理的水6.5uL；總體積為30uL； 70℃溫浴10min。
c. 逆轉錄反應：加入M-Muly逆轉錄酶1.0uL (200units)。離心管放入42℃水浴，60min。
d. cDNA第一鏈合成后的處理：逆轉錄以后在體系中加入1uL逆轉錄酶抑制劑，將離心管放入70℃，水浴10min，-20℃保存。
e. PCR反應條件：94℃5min；94℃40sec；56-58℃40sec；72℃1min，30個循環；72℃5min。陽性對照為水稻Actin基因。
2. 基于MPSS的擬南芥和水稻TLP基因的表達分析
為分析擬南芥與水稻基因組中旁系同源TLP基因組織表達模式，本研究還搜索了擬南芥和水稻MPSS數據庫中的17-bp表達信號來確定其表達模式。首先，在MPSS數據庫中獲得了所有水稻和擬南芥中TLP基因17-bp信號表達的組織。利用公式P=T1/T2求取交疊表達組織頻率。其中T1表示在一對旁系同源TLP基因均會在其中表達的組織數目，而T2表示在一對旁系同源TLP基因中至少一個會在其中表達的組織數目。
3. 基于EST的楊樹TLP基因的表達分析
表達序列標簽(EST)為在mRNA水平上研究目的基因的表達提供了有效的工具。通過對不同數據庫中目的基因對應的EST或cDNA出現的頻率可以來了解其組織表達情況。為分析楊樹基因組中TLP基因的組織表達特征，本研究利用楊樹TLP基因的編碼序列(CDS)搜索了NCBI的EST數據庫。通過對楊樹不同種的基因編碼的蛋白質序列的比較發現：楊樹不同種間的序列是高度相似的甚至是一致的。本研究中不僅采用了楊樹的EST序列，還采用了其他楊樹種和雜交種的EST序列，包括：P. trichocarpa，P. tremula×P alba，P. tremula×P. tremuloides，P. deltoids，P. tremuloides，P. euphratica，P. trichocarpa×P.deltodides，P. trichocarpa×Pnigra and P. tremula。該搜索利用Blasm搜索NCBI的EST數據庫，參數為默認，所得結果的匹配率>95%、匹配長度>160bp且E≤10-10被認為是該基因的EST表達序列。為分析楊樹的TLP基因的組織特異性表達，將所得到的楊樹EST序列根據其組織來源分成了8類組織：花、樹皮、葉、根、芽、木質部、愈傷組織和其他。