5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
7. 2～8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。
8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事項：
1.從少量樣品（1～10mg組織或102～104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800mlTRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600×g離心30～60分鐘。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6～10μg ，腎3～4μg ，骨骼肌和腦組織1～1.5μg ，胎盤1～4μg ，上皮細胞8～15μg ，成纖維細胞5～7μg 。
常見問題分析：
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。
B.RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65 ：
A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。
B.樣品勻漿時加的試劑量太少。
C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。
D.吸取水相時混入了有機相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。
C.細胞在用胰酶處理時過度。
D.溶液或離心管未經RNase去除處理。
E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5 。