注意事項:
1. DNA在中間層和有機相中時可在2~8℃保存過夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2~8℃可保存幾個月。
3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜,如長期保存需用HEPES調節pH至7~8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃長期保存。
常見問題分析:
得率低:
A.樣品勻漿和裂解的不徹底。
B.最終得到的DNA沉淀沒有完全溶解。
A260/A280<1.70 :
A. 檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。
B.酚除去的不徹底,可用0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解:
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃。
C.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀。
RNA污染:
A.氯仿分層后水相去除的不干凈。
B.DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇)洗的不徹底。
蛋白質的提取
準備試劑:異丙醇含0.3M鹽酸胍的95%乙醇無水乙醇1%SDS。
操作步驟:
1.取沉淀DNA后剩余的上清,用異丙醇沉淀蛋白質。每使用1ml TRIzol加1.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘,2~8℃12000×g離心10分鐘棄上清。
2.用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液,室溫放置20分鐘,2~8℃7500×g離心5分鐘,棄上清,重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白質沉淀5~10分鐘,用1%SDS溶解蛋白質,反復吸打,50℃溫浴使其完全溶解,不溶物2~8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存備用。
注意事項:
1.蛋白質沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2~8℃一個月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1% SDS在2~8℃透析三次,10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。
常見問題分析:
得率低:
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。
B.最后得到的蛋白質沉淀未完全溶解。
蛋白質降解:組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
電泳時條帶變形:蛋白質沉淀洗滌不充分。