TRIzolRNA提取方法

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，采用變性劑即內含異硫氰酸胍酚和β-巰基乙醇等變性物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質，并使蛋白質二級結構消失，細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

細胞裂解后，細胞釋放出蛋白質、DNA、RNA等物質，再根據它們在不同的PH值和不同極性溶劑的溶解度不同而使得分開。

細胞樣品

TRIzol試劑 氯仿 異丙醇 75%乙醇 DEPC H2O

離心管 離心機 EP管 勻漿器 移液管 冰袋 漩渦振蕩器

1. 樣品處理：

（1） 培養細胞： 收獲細胞1-5×10⁷，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。

（2） 組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。

2. 加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。

3. 4℃離心，12000g×15min，取上清。

4. 加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。

5. 4℃離心，12000g×10min，棄上清。

6. 加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。

7. 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）

1.樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會使內源性RNase的抑制不完全，導致RNA降解。

2.實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。

一、RNA的定量計算

1.  RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照，根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：

RNA（mg/ml）=40×OD260讀數×稀釋倍數（n）/1000

2.   RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質存在；比值太高，則提示RNA有降解。