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  • 發布時間:2020-06-22 20:28 原文鏈接: TRIzolRNA提取試劑盒操作說明

    TRIzol RNA提取試劑盒是由GIBCO BRL公司推出專供提取RNA的產品,其操作方便、快捷。 在TRIzol中,RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續操作會要求用無RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

    (一)試劑準備

    1.TRIzol試劑。
      2.氯仿
      3.異丙醇
      4.75%乙醇(DEPC H2O配制)
      5.DEPC H2O

    (二)操作步驟

    1. 樣品處理:
      (1)培養細胞:收獲細胞1-5×107,移入1.5ml離心管中,加入1ml Trizol,混勻,室溫靜置5min。
      (2)組織:取50-100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml離心管中,加入1ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5min。
      2.加入0.2ml氯仿,振蕩15s,靜置2min。
      3.4℃離心,12000g×15min,取上清。
      4.加入0.5ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min。
      5.4℃離心,12000g×10min,棄上清。
      6.加入1ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4℃,7500g×5min,棄上清。
      7. 晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。

    (三)注意事項
      1.樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟(1)的比例,不能隨意增加樣品量或減少Trizol量,否則會使內源性RNase的抑制不完全,導致RNA降解。
      2.實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。

    二、總RNA定量

    RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波長分光測定RNA濃度,OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑,用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:
      RNA(mg/ml)=40×OD260讀數×稀釋倍數(n)/1000

    RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0,故根據OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低,說明有殘余蛋白質存在;比值太高,則提示RNA有降解。


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