TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是檢測細胞凋亡的經典方法。本試劑盒采用TUNEL法，應用高活性的基因重組末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞斷裂的DNA 3’-羥基（3’-OH）末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），通過檢測FITC-12-dUTP標記的DNA片段來檢測細胞凋亡。FITC-12-dUTP標記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察，也可用流式細胞儀檢測。本試劑盒已經多次優化，FITC-12-dUTP標記和未標記dNTP處于最佳搭配比例，這樣在進行3’-OH末端核苷酸摻入時，同一個斷裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP摻入，從而大大提高了檢測的靈敏度，減少了背景反應。再加上我們高活性的TdT酶，使得本試劑盒的檢測信噪比大大提升，而背景非常干凈。

TUNEL FITC末端熒光標記凋亡檢測試劑盒的特點：

標記dNTP與未標記dNTP的比例經多次優化，高信噪比，高靈敏度；
TdT酶為基因工程重組產品，活性高，熒光摻入效率高，背景低；
適用于涂片、爬片、石蠟切片和冰凍切片。
試劑盒裝        ~                                                                                                    

產品組成

方法步驟:  

樣品預處理方案

• 石蠟包埋組織切片

• 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5分鐘以徹底脫掉石蠟；

• 用100%乙醇浸泡5分鐘，更換新的100%乙醇再浸泡5分鐘；

• 注意：為得到最好的結果，蛋白酶K孵育時間可能需要優化。

組織冰凍切片

• 將破片浸沒在4%多聚甲應溶液(溶于PBS)中，室溫孵育15分鐘；

• 去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體；

• 將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15分鐘；

• 去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤；

• 用PBS稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度為 20μg/ml；

• 每個樣本上滴加100μl稀釋的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10分鐘；

• 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

• 去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

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細胞片

• 固定細胞，將細胞片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置 25分鐘；

• 洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5分鐘。重復用PBS洗一次；

• 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。這時可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在混盒中保榜樣本的濕潤；

• 用PBS稀釋2 mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度 為20μg/ml，每個樣本需要100μl蛋白酶K溶液；

• 每個樣本上滴加100μl稀釋的蛋白酶 K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵 育5分鐘(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton? X -100溶液中，室溫孵育5分鐘進行通透處理)；

• 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

• 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

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標記及檢測

用去離子水將5×Equilibration Buffer稀釋成1×Equilibration Buffer。

滴加100ul  1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區域，室溫孵育10-30分鐘。同時，在冰上解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，準備足夠量的用于所有實驗和陽性對照反應的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5cm2的一個標準反應，其體積是50μl，用50μl乘以實驗和陽性對照反應的數目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積。

3)在平衡后的區域周圍用吸水紙吸掉多余的 Equilibration Buffer，不要讓組織或細胞發干， 然后在組織或細胞上加50ulTdT孵育緩沖液。

4)把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾，將載玻片置于濕盒內，再將濕盒用鋁箔紙包裹以避免光照, 37℃孵育60分鐘。

表1.準備用于實驗和陽性對照反應的TdT孵育緩沖液     

• 組    分	體    積 （μl/50μl體系）	樣本數目 （實驗+陽性對照數）	總體積 （μl）
  dd H2O	34
  5×Equilibration Buffer	10
  FITC-12-dUTP Labeling Mix	5
  Recombinant TdT Enzyme	1

  5)  移除蓋玻片，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5分鐘。

   

• 6)  輕輕去掉多余液體，換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5分鐘。重復該步驟1次。

   

• 7)  用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

   

• 注意：為了降低背景，可以嘗試載玻片在步驟5用PBS洗一遍之后，再用含0.1% Triton? X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次（取代步驟6），每次5分鐘，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。

   

• 8)  將載玻片浸入裝有PI溶液的染色缸，暗室室溫放置5分鐘，此 處PI溶液是用PBS新配稀釋到1μg/ml的。

   

  9)  洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘，共洗三次。 

   

  10)  將載玻片上多余的水吸干，但組織或細胞保持濕潤。 

   

• 11)  立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過濾裝置在520 ± 20 nm的熒光下觀察綠 色熒光。在>620 nm下觀察PI的紅色熒光。如有必要，載玻片可在4℃ 黑暗條件下存放過夜。

   

• 3. 陽性對照制備：如有必要，可按下述制備陽性對照。

•     1) 在樣本預處理之后，加100ul DNA酶I緩沖液到固定的細胞上，室溫孵育5分鐘；

  2) 輕去液體，加入100μl含5.5-10units/ml DNA酶I的緩沖液，室溫孵育10分鐘；

  3) 輕叩載玻片去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗3-4次。

• 注意：陽性對照載波片必須使用單獨的染色缸。否則來自陽性對照載玻片上殘余的DNA酶I活性可能會在實驗載玻片上引入高的背景。

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用梯度乙醇（90、80、70%）將切片各浸洗一次，每次3分鐘，逐漸增加水分；

用PBS輕輕潤洗切片，并用濾紙吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤；

用PBS稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度為20μg/ml；

每個樣本上滴加100μl稀釋后的蛋白酶K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20分鐘；

用PBS溶液潤洗樣品。輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。