|
一、檢測試劑
1. PMA 貯存液：PMA 溶于 DMSO，濃度為 0.1
mg/mI，-20℃ 保存，工作液貯存液 1：100 稀釋于 RPMI-1640 或 PBS（無菌，無疊氮鈉）中，此時為 1
ug/ml，工作濃度為 25 ng/ml，取 25 ug/ml 原液稀釋即可。
2. 依諾霉素貯存液：依諾霉素溶于
DMSO，濃度為 1 mg/mI，-20℃ 保存；工作液：貯存液 1：20 稀釋于 RPMI-1640 或 PBS（無菌，無疊氮鈉）中，此時為
50 ug/ml，工作濃度為 1 ug/ml，取 20 ug/ml 原液稀釋即可。
3. 莫能星 (monensin):
貯存液：莫能星溶于甲醇，濃度為 50 mg/mI，為加速溶解，可置于 40~43℃ 水浴。4℃ 只少保存 4 個月；工作液：貯存液 1：50
稀釋于 RPMI-1640 或 PBS（無菌，無疊氮鈉）中，此時為 1 mg/ml；工作濃度為 1.7 ug/ml（取 17 ul/ml）。
4. RPMI-1640，RPMI-1640 含 10% FCS（胎牛血清），2 mmol/L 谷氨酰胺 50 ug/ml 青霉素，50 ug/鏈霉素和 100 ug/ml 新霉素。
抗體：細胞表面標志抗體；CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC。
細胞內因子：IL-4-PE，IFN-Y 等。
破膜劑：可用美國 Caltag 公司的 Fix & Perm 破膜劑；美國 BD 公司的 FACS 破膜劑；法國 Immunotech 公司的 IntraPrep 破膜劑。
二、檢測步驟
1. 肝素抗凝采血。
2. 取 2 只試管，分別作為陰性對照管 (A 管) 和測定管 (B 管)，于 2 只試管中均加入 100 uI 血液和 100 uI PRM1-1640。
3. A 管中加入 3.4 ul 1 mg/ml 的莫能星工作液，B 管中加入：5 uI 1 ug/ml 的 PMA 工作液+4 uI 50 ug/ml Ionomycin 工作液+3.4 ul 1 mg/ml 莫能星工作液。
4. 37℃，5% CO2 培養箱培養 4~6 h。
5. 混勻，取出 100 uI，加入適量 CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC，孵育一段時間（參閱抗體說明書）。
6. 用破膜劑固定和破膜。
7. 加入適量 IL-4-PE，IFN-y PE，孵育一段時間 (參閱抗體說明書)。
8. PBS 洗一次，去上清；適量 PBS 重懸細胞沉淀，上機檢測。
三、結果分析
1. 用 CD3 設 門，選定 T 淋巴細胞。
2. 用 CD8 分別和 IFN-γ建立雙參數直方圖對第一步所確定的淋巴細胞進行分析。
3. 得出 CD8/IFN-γ+（Th1）和 CD8-/IL-4+（Th2）細胞百分含量。
展開 | 