1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；
蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趨化因子的制備 取傳代第二天長勢良好的NIH3T3細胞,無血清培養基輕柔漂洗兩次; 加入無血清培養基,37℃,5 %CO2 培養24 h～48h，收集細胞培養上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清；0.22 μm 濾膜過濾除菌；分裝,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培養板準備 所有操作均需無菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取100μl Matrigel 加入冰預冷的300μl 無血清培養基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培養板置于37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各組細胞用PBS 漂洗3 次。以常規方法用無血清培養基制備單細胞懸液,5 ×105個細胞/ ml ,每組細胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實驗,細胞活力需大于95 %。Transwell 培養板上室加入100μl 細胞懸液( 5 ×104 個) 并加入無血清培養基200 ul 。Transwell 培養板下室加入500μl 趨化因子,37℃,5 %CO2 培養24 h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞。小心取出上室,用線拴住,并做好標記,用冰預冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的細胞在高倍鏡下( ×400) 隨機取6 個視野[1 ] 計數,取平均數。重復實驗兩次。