2. 1
NIH3T3 細胞制備的趨化因子與胎牛血清 趨化因子是能使細胞產生趨化運動的一類細胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗的實驗室比較多,時間較長且實驗步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們在不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗中發現用胎牛血清和用NIH3T3 細胞制備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的,兩組遷移的細胞數很接近。在實驗時間上，用NIH3 T3細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2 d ,實驗時間節省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3 細胞制備的趨化因子。
2. 2 細胞的準備 所需細胞應處在對數生長期,細胞活力需大于95 %。如果細胞活力小,就會造成細胞穿透能力下降,影響實驗結果。
2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞 先用干棉簽將上室內液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞,如果沒有擦凈聚碳酯膜上表面的細胞,在細胞計數時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是細胞為圓形的時候,就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞,對于長梭形細胞來說,穿過去的細胞為長梭形,沒穿過去的細胞多為圓形。
2. 4 蘇木素染色 上室浸泡在新蘇木素中的時間為1 min ,用過多次的蘇木素為2 min。在研究粉防己堿對HUVEC 人類臍靜脈內皮細胞遷移能力的抑制作用沒有將多余蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細胞圖片背景模糊,細胞不清楚。在作不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置于盛有自來水的燒杯中,反復漂洗幾次,將多余蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細胞圖片背景干凈,細胞清楚。
2. 5 脫水和透明時間 脫水時間各為1 min ,在二甲苯中的時間不要過長,以2 min～3 min 為宜;尤其是同時操作多個樣本時,時間過長就會造成部分聚碳酯膜從上室基底部自動脫落下來,上室間粘連在一起,造成樣本混淆,實驗失敗。建議在最后一步實驗時需二人協做,一人辨別并取出樣本,一人小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片并及時編號。
2. 6 細胞計數 當實驗用的細胞為圓形時,實驗人員容易將聚碳酯膜上小孔誤認為細胞進行計數。我們在作VEGF 對人結腸癌HT229 細胞體外侵襲能力的影響時,發現HT229細胞很小,很容易將聚碳酯膜上小孔誤認為細胞進行計數 。