UPLCESIMS／MS技術分析柑橘果皮中黃酮類代謝物

　　大紅袍柑橘(DHP)是一種古老的柑橘品種。其果實和果皮富含營養物質和生物活性化合物，因其抗氧化性和極高的藥用價值而廣受歡迎。據報道，大紅袍柑橘果皮中總黃酮含量是柑橘品種中含量最高的，已被列入我國柑橘的重點保護品種。黃酮類化合物具有許多生物學功能和保健作用，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎癥等。許多研究者對柑橘品種中的生物活性成分進行了分析和檢測。然而，這些方法都存在只檢測少量化合物的缺點，不能系統、全面地描述柑橘屬植物的化學成分。廣泛靶向代謝組技術，由于具有通量高、靈敏度高、覆蓋范圍廣等優點，在植物代謝產物分析鑒定領域得到了廣泛的應用。本研究采用廣泛靶向代謝組技術對大紅袍柑橘及其它4個柑橘品種果皮中黃酮類代謝物進行了分析。有助于進一步了解大紅袍柑橘果皮與其它四種柑橘果皮之間的黃酮類代謝物特點，對其充分利用和開發具有重要意義。

　　研究結果

　　1.總黃酮含量的測定

　　本研究以網紋大紅袍（DHP）和其他四種柑橘品種化州柚（HZY）、宜昌橙（YCC）、甜橙（TC）、布之火（BZH）為材料，測定其總黃酮含量。采用普通單因素方差分析方法對數據進行分析。DHP果皮黃酮含量高達122.5 mg/g，明顯高于HZY、YCC、TC、BZH，其中BZH的黃酮含量在50.1 mg/g居第二位（圖1）。

　　2.代謝特征分析

　　基于UPLC-ESI-MS/MS技術和代謝物數據庫，研究了大紅袍及其它4個柑橘品種果皮中黃酮類化合物。共鑒定出254種黃酮類代謝物，其中黃酮147種，黃酮醇39種，黃烷酮21種，花青素24種，異黃酮8種，多酚15種。聚類分析顯示，DHP中黃酮類代謝產物的含量與YCC和HZY相比差異較大， YCC和HZY中黃酮類代謝產物的含量基本一致。雖然DHP、BZH和TC被歸為一類，但其代謝物含量也有很大的差異。結果表明，DHP與其它4個柑橘品種有明顯的區別。

　　3.樣品主成分分析

　　在PCA得分圖中，DHP、YCC、TC、HZY和BZH 5組樣品明顯的分開，生物學重復樣品聚集在一起，表明實驗是可重復和可靠的。三維PCA圖中，可以更直觀地看到樣本的分離趨勢（圖2）。

　　4.基于OPLS-DA的黃酮代謝產物鑒別分析

　　正交信號校正和偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是篩選不同代謝物的一種有效的多元統計方法，它能最大限度區分組間差異。Q2是評價OPLS-DA模型的一個重要參數。Q2大于0.9表示一個優秀模型。在本研究中，OPLS-DA模型比較了兩組樣本中黃酮代謝物的含量，以評估DHP和YCC（R2X =0.964，R2Y =1，Q2=1）、DHP和TC（R2X =0.948，R2Y =1，Q2=0.999）、DHP和HZY（R2X =0.964，R2Y =1，Q2=1）之間的差異。在DHP和BZH之間（R2X =0.864，R2Y =1，Q2=0.998）。所有比較組的Q2值均超過0.9（圖3），因此證明這些模型穩定可靠，可用于進一步篩選不同的類黃酮代謝物。

　　5.黃酮類代謝產物鑒別篩選、功能注釋和富集分析

　　篩選Fold Change大于等于2或小于0.5和VIP值大于等于1的代謝物作為差異代謝物。火山圖（圖4）顯示，DHP和BZH比較組有52個差異顯著的黃酮代謝物（21個下調，31個上調），DHP和HZY比較組有100個（64個下調，36個上調），DHP和TC比較組有68個（41個下調，27個上調），DHP和YCC比較組有97個（65個下調，32個上調）。與DHP相比，BZH的黃酮類代謝物上調，HZY、TC和YCC下調。此外，在所有比較組中有169種不同的代謝物，26種下調代謝物在DHP中顯示出重要的生物活性（表1）。在韋恩圖（圖5 a-b）顯示了各比較組8種共有的差異代謝物，及每組樣品中共檢測到11種特異的代謝物，其中丁香醇僅存在于DHP中，不同的代謝物可以明顯的區分DHP和其他柑橘品種。

　　KEGG分類結果和富集分析（圖5 c-f）表明，比較組的不同黃酮類代謝產物參與了異黃酮的生物合成、黃酮的生物合成、2-苯基色原酮和黃酮醇的生物合成以及花青素的生物合成。

　　研究結論

　　本文采用廣泛靶向代謝組技術，對大紅袍柑橘果皮及其它4個柑橘品種果皮中的黃酮類代謝產物進行了系統的分析和鑒定。共檢測到252種黃酮類代謝產物，117種為各樣品共有化合物，169種為在所有差異比較組中的代謝物，其中8種為共有的差異代謝物。同時在所有樣品中共檢測到11種特異的代謝物，其中丁香醇僅存在于DHP中，可作為區別于其它4個柑橘品種的鑒別標志物。此外，DHP皮中總黃酮含量高于其他樣品，26種下調的代謝物在DHP中表現出重要的生物活性。因此，DHP的果皮具有很大的開發利用潛力。