WB又稱免疫印記法.是將生物大分子物質通過不同途徑轉移到固相載體的過程。其靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。今天給大家分析的是western blot實驗中那些常見的問題，這份干貨內容，請收好啦！
western blot 常見問題有那些？
1.為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？
答：原因有很多，①你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；②你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMST，抑制蛋白酶活性；③你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
2.我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：①有沉淀可能是因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長。②也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量sample buffer即可。
3.我做的蛋白質分子量很小（10KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇PSQ膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
4.我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是*主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
實驗方法互助區——蛋白區
5.膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，牛奶濃度提高。
6.目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。
7.我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
①二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；②ECL底物中H2O2，不穩定，失活；③ECL底物沒覆蓋到相應位置；④二抗失活。
8.問我顯影液顯影1分鐘，和5分鐘后，底片漆黑一片，是什么原因呢?
答：①可能是紅燈造成的，可以在完全黑暗的情況下操作，看是否有改善。膠片本來就被曝光了②顯影時間過長。
9.DAB好還是ECL好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP *敏感的底物；ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。
10.抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？
答：抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至8M也可以打開。
11.半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大小？
因為膠大小不一定規則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發現短路呢？
答：一般參照膜>= 濾紙> 膠, 就行，你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， *后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。
12.電泳時Marker 按說明加5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？
答：加入20ul即可。
13.蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什么了？
答：可能是1樣品濃度過低2轉移時間不夠。
14.我的一抗量較少，同時我也不知道一抗的*佳稀釋比例是多少，怎么做呢？
答：確定實驗過程無污染后，將含抗體的稀釋液回收，保存于-70℃。次的濃度做高一點，這樣，如果結果不好，可以嘗試再稀釋。