1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。原因： 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書，設置陽性對照。原因：一抗不識別檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低于20~30μg，設置陽性對照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉膜效果，檢測轉膜操作是否正確。PVDF膜預先浸在甲醇中。原因：轉膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑，減少封閉時間。原因：過度封閉使目標蛋白不能顯色。
更好的解決多條帶現象的5點建議：
1.查閱文獻。原因：體內表達的蛋白具有多種修飾形式，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因：蛋白樣本降解（蛋白質分子量降低）。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時間。原因：一抗濃度過高，高濃度時常出現多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平行對照試驗。原因： 細胞傳代次數過多，使其蛋白表達不同。
5.降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。原因：二抗濃度過高，高濃度產生非特異結合
更好的解決背景高的5點建議：
1.稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間。
2.抗體孵育溫度過高： 4℃孵育。
3.膜干燥：保證充分的反應液，避免出現干膜現象。
4.封閉不充分： 延長封閉時間， 考慮更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未結合蛋白洗滌不充分： 增加洗滌次數。
更好的解決其它問題的5點建議：
1.轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點：抗體結合了封閉劑（過濾封閉劑）。
3.“微笑”條帶：遷移過快或電泳溫度過高，改變了pH值和遷移速度（降低遷移速度或低溫電泳）。
4.抗體量不足：確保在孵育時抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高：分離不徹底。