Western blot（WB）是檢測蛋白質及蛋白質翻譯后修飾的經典方法，可在簡單或復雜的生物樣品中提供有關靶蛋白的半定量或定量數據。WB 步驟復雜，通常包括：
蛋白樣本制備→電泳→轉膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→顯影→分析。
WB 任何過程出現 Bug 均可影響結果的重復性與靈敏度，因此必須注意將 WB 的每個步驟標準化。今天給大家分享 WB 各個過程中需要注意的細節！
樣品制備
有效的樣品制備是影響 WB 可重復性的非常重要的因素。需考慮以下問題：
1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，細胞質/膜蛋白？
2、溶解的蛋白或其翻譯后修飾的維持是否需要添加額外的緩沖成分 (例如洗滌劑、酶抑制劑)？
3、蛋白質定量的方法是什么，緩沖成分會干擾蛋白定量嗎？
BCA 蛋白定量檢測法是總蛋白質定量的常用方法，其蛋白間差異較考馬斯染料法的更小，但與還原劑、螯合劑不兼容（兼容去垢劑）。
電泳
1、最合適的凝膠濃度是什么？不同分子量的蛋白分離膠濃度對應表：
2、哪種電泳緩沖液最合適？
例如，3 -(N-嗎啡啉）丙磺酸緩沖液（MOPS 緩沖液）適合～75KDa 的蛋白質，2 -(N-嗎啉基) 乙磺酸緩沖液 (MES 緩沖液) 適合<36KDa 的蛋白質。
3、電泳多長時間和以及電泳條件？
4、蛋白質的分子量遷移情況如何？
蛋白質的分子量遷移因凝膠類型、濃度和電泳緩沖液的不同而不同。對應情況如下：
轉膜
1、什么是最合適的膜？例如，PVDF 膜或 NC 膜（0.45μm）。PVDF 膜有兩種規格，0.45μm 的膜適用于檢測大于 20KDa 的蛋白質，0.2μm 膜適用于小于 20 的蛋白質。PVDF 需要在甲醇中浸泡 1 - 2 min 激活。不同分子量蛋白轉膜條件：大于 150KDa 蛋白可恒壓 20V 4 度濕轉過夜。
2、轉膜液甲醇濃度如何？
小分子量蛋白的轉膜需要注意：
（1）高濃度的凝膠有利于小分子量蛋白的分離。一般在目的蛋白離凝膠前沿 0.5 - 1 cm 時停止電泳，太靠近凝膠前沿易引起邊緣效應。
（2）SDS 阻止蛋白與膜的結合，小蛋白更是如此。因此電轉液中可以不加 SDS。
（3）保持甲醇濃度 20%。
大分子量蛋白的轉膜需要注意：
（1）而甲醇易使 SDS 從蛋白上脫離，因此適當降低甲醇濃度至 10% 或更低，防止蛋白沉淀。
（2）降低電轉液中甲醇的含量，這樣可以促進凝膠的膨脹，更易于大分子量蛋白的轉出。
（3）使用硝酸纖維素膜時，甲醇是必需的。如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入電轉液，但需要預先用甲醇活化。
3、是否應進行膜染色以評估轉膜效率？
麗春紅染色可在膜上看見清晰、連續的粉紅色條帶，無白色圈圈出現。轉膜不佳時，條帶色淡、有氣泡，甚至無條帶。
封閉
封閉液中可與固相載體表面的空白位置結合，同樣以機械填補 (堆積) 和吸附覆蓋的方式結合在膜上。
1、何種封閉液最合適（例如 BSA 或脫脂牛奶）？
脫脂奶粉成分復雜（多種蛋白質的混合物），磷酸化抗體可能會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統。BSA 也是非常常用的封閉液，但 BSA 可能含有 IgG 或其他血清蛋白等污染，這些蛋白可以與某些抗體產生交叉反應，增加非特異性信號。
但需注意，過度封閉也會導致靶蛋白的信號強度變弱。研究者發現有些抗體在室溫下孵育 2 - 4 小時會產生比在 4℃ 溫育過夜時更強的信號。
2、封閉液應該使用什么濃度 (例如，2.5%) 和什么緩沖液 (例如，TBST)？
孵育一抗
1、一抗的一般特征是什么 (例如單克隆兔 IgG)？
2、一抗對天然蛋白或變性蛋白特異嗎？識別表位序列/區域是否已知？
3、一抗是否存在已知的其他條帶？
蛋白質分子量不對時蛋白質可能存在降解，翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、前體蛋白剪切等。
4、是否設置了適當的對照以確定抗體的特異性？
使用陽性和陰性對照可以容易地確定抗體的特異性。最好的陽性對照是過表達目標蛋白的純化蛋白質或裂解物，而最好的陰性對照是來自敲除動物組織的組織或細胞裂解物。如果無法獲得過表達目標蛋白的純化蛋白或裂解物，許多公司如
Aviva Systems Biology，Cell SignalingTechnology 和 Santa Cruz
Biotechnology 都可以獲得許多組織和細胞的裂解物，可用作陽性對照（已知靶蛋白在這些組織或細胞中高度表達）。
孵育二抗
1、二抗是什么標記結合的（HRP 或熒光）？
2、二抗是否特異性針對一抗？
3、是否存在可檢測/過度曝光的信號，如果是，是否需要調整抗體濃度？
顯影
1、采用什么顯影方法（化學發光還是熒光）？
2、顯影相關試劑是否正確儲存？
3、膜是否可以剝離抗體進行重新檢測？哪種抗體剝離緩沖液最適合我的實驗？
分析
1、目的條帶是否在檢測系統的線性范圍內？
2、哪種量化方法最適合 (全泳道或分析單獨目的條帶)？
3、歸一化方法是什么？
使用內參蛋白是歸一化的常用方法，其前提是假定內參蛋白在實驗條件下保持穩定。內參蛋白與目的蛋白與分子量需至少相差 5KDa 以上。常用內參抗體分子量及定位：
IGF- 1 處理 C2C12 細胞檢測 eEF2 水平，發現不同內參蛋白對處理存在變異性：4、如何正確的呈現 WB 圖片？
通常
WB 數據以代表性圖像的形式呈現，以反應干預的效果和 WB 的質量。這就存在呈現圖像時的倫理問題，論文中的 WB
圖像需要準確呈現量化數據的結果。WB 圖片呈現是學術不端的重災區，例如來自多個 WB
的圖像的拼接以形成一個連續的圖像可能會模糊樣本之間的變化的大小：
此外過飽和的 WB 會導致感興趣的條帶之間沒有明顯的區別：
調整對比度以遮蔽雜帶（c）、圖像處理以增強、減少或移除條帶（d）也是不被允許的：
已發表 SCI 論文 WB 條帶存在問題舉例：
替代 WB 的新興方法
一種常見的 WB 替代方法是使用免疫酶聯吸附反應（ELISA）來定量目標蛋白 (總蛋白或磷酸蛋白) 的豐度。
相比
WB 而言 ELISA 的優勢有：樣本容量大（例如 96 孔板）、靈敏度高、可絕對定量（使用標準品）、耗時短（2 - 4 小時）等。當然
ELISA 也存在一些問題，例如不同分子量的蛋白質無法相互區分、使用的一抗可能產生虛假高信號、不能進行重新檢測等。
另一項新興的技術是使用蛋白質芯片來檢測單個樣本中多個目標蛋白質的存在，甚至 DNA 和 RNA 的潛在蛋白質相互作用，并可測量酶的活性。此外，用于蛋白質分析和極其精確定量的質譜 (即 LC-MS/MS) 的使用正變得越來越廣泛。
質譜比 ELISA 和傳統的 WB 技術都具有明顯的優勢，在高靈敏度和寬動態范圍 (0.5 - 500 ng/μl) 下可以區分多種蛋白質亞型。然而質譜分析需要高度專業化、昂貴的設備和技術，在實驗室中使用也越來越常見。
質譜可與 WB 聯用來確認抗體特異性、確定 IP 后新的蛋白質-蛋白質相互作用、以及發現翻譯后修飾等。
WB 疑難解析
今天給大家分享 WB 注意事項就到此為止了，希望對大家有所幫助，祝大家一切順利！