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  • 發布時間:2020-06-09 21:46 原文鏈接: Western印跡法(試劑配制和操作步驟)(下)

    (二)使用液

    單去污劑裂解液(50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%SDS,1mmol/L PMSF):
    1mol/L Tris?HCl(pH8.0)2.5ml
    NaCl                                    0.438g
    10%SDS                          0.5ml
    200mmol/L PMSF        2.5ml

    蒸餾水至                               50ml 

    若檢測磷酸化蛋白,需加入100ul 5mol/L NaF和500ul 100mmol/L激活礬酸鈉,混勻后, 4℃保存。

    G250考馬斯亮藍溶液(染膠專用)
    考馬斯亮藍G250:  0.063g
    甲醇:                 15ml
    乙酸:                   5ml
    蒸餾水至                50ml
    溶解后,4℃保存。

    分離膠(兩塊膠,10ml)
                                                       8%               10%              12%              15%
    超純水                                              4.6ml            4.0ml             3.3ml             2.3ml
    30%Acr/Bic(29:1)                  2.7ml             3.3ml             4.0ml             5.0ml
    1.5 mol/L Tris?HCl(pH8.8)       2.5ml              2.5ml             2.5ml             2.5ml
    10%SDS                                          100ml            100ml            100ml            100ml
    10%AP(過硫酸胺)                       100ml             100ml            100ml            100ml
    TEMED                                               4ml              4ml               4ml               4ml
     加 TEMED后,立即混勻即可灌膠。

    4%濃縮膠(兩塊膠,5ml)
    超純水                                                   2.1ml
    30%Acr/Bic(29:1)                      0.5ml 
    0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8)             0.38ml
    10%SDS                                                30ml 
    10%AP(過硫酸胺)                            30ml
    TEMED                                                     3ml 
     加 TEMED后,立即混勻即可灌膠。

    還原型5XSDS上樣緩沖液(0.25mol/L Tris/HCl pH6.8,0.5mol/L二硫叔糖醇,10% SDS,0.5%溴酚藍,50%甘油)
    0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8)              0.5ml
    二硫叔糖醇(DTT,MW154.5)         0.078g
    SDS                                                         0.1g
    10%溴酚藍                                               0.05ml
    甘油                                                         0.5ml

    混勻后,分裝于1.5ml離心管中,4℃保存。

    電泳液緩沖液(25mmol/L Tris,0.25mol/L甘氨酸,0.1% SDS)
    Tris(MW121.14)             1.515g
    甘氨酸(MW75.07)          9.385g
    SDS                                       0.5g
    蒸餾水至                               500ml
    溶解后室溫保存,次溶液可重復使用2~3 次。

    轉移緩沖液(48mmol/L Tris,39mmol/L甘氨酸,0.01% SDS,20%甲醇)
    甘氨酸(MW75.07)            2.9g
    Tris(MW121.14)              5.8g 
    SDS                                       0.1g 
    甲醇                                      200ml
    蒸餾水至                              1000ml
    溶解后室溫保存,次溶液可重復使用2~3次。

    10X麗春紅染液
    麗春紅S        0.2g
    三氯乙酸         3g
    磺基水楊酸      3g
    蒸餾水至        10ml
    溶解后,避光4℃保存,使用時將其稀釋10倍,稀釋液勿回收。

    TBS緩沖液(10mmol/L Tris/HCl pH7.5, 150mmol/L NaCl)

    1 mol/ LTris?HCl(pH7.5)  10ml
    NaCl                                 8.8g
    蒸餾水至                          1000ml
     
    TBST緩沖液(含 0.05%Tween20的TBS緩沖液)
    20%Tween20        1ml
    TBS                       400ml
    混勻后即可使用,最好現用現配。

    封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)
    脫脂奶粉(國產,安怡牌)          2.5g
    TBST                                            50ml
    溶解后4℃保存。使用時,恢復室溫,用量以蓋過膜面即可,一次性使用。

    洗脫抗體緩沖液(100mmol/L 2-Mercaptoethanol,2%SDS,62.5m mol/L Tris?HCl pH6.8)

    14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇)     700 ml (通風廚里加)
                   SDS                                                       2g
             0.5mol/L Tris?HCl(pH6.8)                 12.5ml
                超純水至                                              100ml
    配制時,在通風廚內進行。 4℃保存。可重復使用1次。

    ECL化學發光試劑
    promage產品,分A和B兩種試劑,使用時等體積混合,每張膜使用混合液體積1ml。


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