WesternBlot樣品制備注意事項及步驟

Western Blot樣品制備是這個實驗的第一步。而且是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質。所以我們在做wtstern blot實驗應注意以下問題：

1：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。

2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。

3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

4：防止蛋白質在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）

5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態置-80℃中保存，但要注意不要反復凍融。

下面我們詳細介紹一下western blot實驗的詳細步驟。

一.準備工作：

一個水浴箱，一臺超聲裝置，組織勻漿器

二.需要的溶液：

裂解液 Laemmli樣品緩沖液

三.操作步驟：

1)培養細胞蛋白質樣品的制備：

1：胰酶酶解后裂解：

細胞培養至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細胞經預冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反復吹打。

2：皿上直接裂解：

細胞培養至80%左右密度時，細胞經預冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉移至離心管中，反復吹打。

以上所得的樣品最終用超聲細胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進行，后4℃25000g離心1小時取上清或以最大強度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強力混勻，樣品置100℃水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月）。

2)組織樣品的制備：

手術切除的組織塊迅速置于預冷的0.95生理鹽水中，漂洗數次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細胞培養的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質樣品溶解在適當的上樣 buffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月。）