NN. 用的是Roche molecular
Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western
Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉印的。前幾次做Western
Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！
解答：1、“我用的是Roche molecular
Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western
Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。”有的時候，Prestained Marker
放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。
2、“前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。”轉移時半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。
3、“再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。”
是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這么大的蛋白最好轉移時間延長到1.5hrs。
6. 染色的選擇
OO. Western Blot哪種染色好？
解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去
，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩定。
（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
7. 參照的疑問
PP. 是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？
解答：對于發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。
QQ. 用BANDSCAN分析結果行嗎？
解答：分析一般的結果沒問題。
RR. 核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？
解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。
SS. 轉膜時采用電流是否比電壓準確，是否根據0.8mA/cm2，一般1小時左右？
解答：不是的， 半干法推薦用恒流，一般根據目的蛋白的大小來確定電流和時間。
TT. 做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內參B-actin，GAPDH，那個好？
解答：選用beta-actin就可以。
8. 緩沖液配方的常見問題
UU. 轉膜后的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？
解答：轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。
VV. 準備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質位于細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發生？
解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW. 想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？
解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。
XX. 最近作了兩次Western
Blot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是
1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為
0.1%，不會是封閉液的問題吧？
解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1. 封閉液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。