CCC. Western Stripping Buffer的配方
解答：METHOD1
1、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS
二次發光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分鐘，搖床上搖10-20分鐘。
2、1*PBST洗：搖床上搖30分鐘。
3、封閉，加一抗，二抗（同第一次發光）
METHOD2
（50ml總量）：?-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。
方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時你已經可以按新的轉移好的膜來再次使用了。
該方法的優點：省事，省力，省錢，符合國際慣例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
METHOD4
stripping buffer應該是可以放置很久的。不過我習慣于現配——畢竟，加了β-mercaptoethanol
以后太難聞了，配了就用；而且，有了現成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現配還是很方便的。每次用量5ml少了點，我每次用50ml。
METHOD5
0.5M NaCl，0.5M HAc；室溫搖床15min。
METHOD6
將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同第一次發光），實踐證明方法完全可行。
不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。
9. 條件的摸索
DDD. 用的是Santa
Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發現大分子量蛋白轉過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解
-80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。
3、轉膜，建議恒壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經也轉過2小時，但和45分鐘的區別并不大。
4、根據MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗濃度。
6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。