GGG.我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉膜，下半時間短，上半時間長一點，應該會好一些。
HHH.請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。
III.1、煮好后的樣品，若沒有及時上樣分離，應如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊？3、濕式轉移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉移的條件如何確定，因為我要分離小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質，轉移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個線形范圍，是不是不在這個范圍內也能分離，只是就不是線性范圍了？
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們在一個月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。
3、轉移時一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉移條件是和蛋白質大小有關的：以次確定電壓和時間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質大小有關。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。
JJJ.怎樣設計實驗來確定最佳的條件？
解答：隨便說一點， 具體的還是需要自己想：
1、在每個上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1 個大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-page；
2、轉移， 設定電流或電壓；
3、每隔 1（or n） 小時，取一點膜染色，看轉移效果。
KKK.我要測兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒什么效果？
解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。
LLL.1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復合物時，每次要重懸多長時間合適？2、最后用2xSDS重懸抗原-抗體復合物離心后，由于2XSDS中已經加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時也不知道里面是否吸進了Agarose。不知有什么方法可以解決這個問題，或者即使吸進了一些Agarose也不要緊呢？
解答：1、不用重懸多久，重懸起來了就可以離心了。
2、加2X
BUFFER前大體上已經知道有多少膠粒了，吸到那個位置時小心點就是了。我也試過一些次，首先離心稍微長一點，長20秒吧，希望膠粒能沉得結實點（我想象的），再吸取。如果感覺槍頭不是很順暢的時候可能就是碰到膠粒了。很難一點膠粒也吸取不上來的，盡力做好就是了。
MMM.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。我做的時候從未加過，都做出來了。
NNN.Western Blot中block的最短時間?
解答：每一步1小時足夠了，
中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時間10分鐘就夠，洗3次只要半小時。跑膠1小時，
轉移1小時，block半小時就行，1抗1小時，洗半小時，2抗1小時，洗半小時，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色，
一塊western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。
OOO.想用Western檢測基因轉染后細胞培養上清中表達的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？
解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、轉移時的時間，
2、轉移時的電流或電壓.
3、transfer buffer 中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分離膠.
PPP.蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉，請問多大電流，多長時間比較合適？
解答：分子量比較小，最好是用干轉，濕轉效率太高，易轉過了。干轉的話，用2.5 A/cm2， 30min就應該夠了。濕轉，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。
QQQ.需要測同一種蛋白質的總量與磷酸化的量，但相互間干擾太大，怎么辦？
解答：將膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巰基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分鐘，TTBS西三次，再重新加入一抗，進行另一種抗原的檢測。
RRR.做Western Blot實驗時，發現轉膜時的電流總是偏小，轉膜的效率也偏低. 100V恒壓轉膜時的電流只有190mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一樣，只是環境溫度比以前低了很多。
解答：有可能重復使用了轉移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來越大，當然恒壓時電流越來越小了。建議更換轉移緩沖液。反復使用不要超過三次。環境溫度低是有利于轉移的。
SSS.我電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。一抗我買的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應該出條帶呀！細胞用三去污劑裂解的，沒有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？
解答：1、建議您用恒壓進行電泳，先用70V，等跑過積層膠與分離膠的界限時，換用90-100V，再跑3小時左右。2、轉膜可用恒流，但要根據你的膜的面積及所要檢測的蛋白的分子量的大小來確定電流的大小，一般來講，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的電流大些，譬如，你膜的面積是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的條件進行，你就可以60mA的電流進行。3、我覺得你的抗體應該沒問題。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我們實驗事都是保存在-20度的，提出蛋白分裝保存在-20度。