WesternBlot詳解（四）

還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。

5.Marker的相關疑問

MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。

NN.用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。”有的時候，Prestained Marker 放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。
2、“前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。”轉移時半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。
3、“再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。”
是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這么大的蛋白最好轉移時間延長到1.5hrs。

6.染色的選擇

OO.Western Blot哪種染色好？
解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩定。
（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

7.參照的疑問

PP.是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？
解答：對于發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。

QQ.用BANDSCAN分析結果行嗎？
解答：分析一般的結果沒問題。

RR.核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？
解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。

SS.轉膜時采用電流是否比電壓準確，是否根據0.8mA/cm2，一般1小時左右？
解答：不是的， 半干法推薦用恒流，一般根據目的蛋白的大小來確定電流和時間。

TT.做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內參B-actin，GAPDH，那個好？
解答：選用beta-actin就可以。

8.緩沖液配方的常見問題

UU.轉膜后的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？
解答：轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。

VV.準備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質位于細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發生？
解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。

WW.想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？
解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。

XX.最近作了兩次Western Blot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會是封閉液的問題吧？
解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1. 封閉液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。

YY.加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。

ZZ.“轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.

AAA.封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規定呢，比如現在我就在室溫里做，或者要在4度下?
解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。

BBB.實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT
蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)