四、化學發光信號
4.1 信號捕捉
雖然化學發光蛋白質印跡法十分常用，但是對于難于捕獲的信號的捕捉卻很棘手。蛋白質印跡法要用到一系列需要技巧的技術，因此許多因素都會導致無法捕捉到信號。由于變量較多 (表 33. 2)，問題印跡的問題診斷和排除就如同大海撈針一樣困難。傳統的方案在檢測某一個蛋白質時通常都是無效的。例如 ， 一 抗可能無法識別變性狀態下的固定化抗原。盡管在非變性環境下蛋白質可保持天然狀態，但這卻使得目標蛋白質分子質量的確定更具挑戰。此外，超大型或疏水蛋白質通常會阻礙有效的膜轉移。另外，小型蛋白質 (小于等于 10 kDa) 會從膜孔中穿出，無法與膜結合。因此, 為確保能夠用于檢測靶物質，Towbin 的原始方案一再被修改。這些修改包括使用不同的試劑進行間接檢測或 4標記的一抗進行直接檢測。有時可以完全跳過轉移這一步驟，在凝膠內完成檢測（Desaiet al.,2001)。
體 持 續 時 間 取 決 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。產 生 了 多 少 光 、這 些 光 能 持 續 多 久 , 則 取 決 于 具 體使 用 的 底 物 以 及 系 統 中 酶 與 底 物 之 間 的 比 例 。盡 管 用 于 一 個 印 跡 的 底 物 量 相 對 恒 定 ，呈現 的 酶 的 數 量 卻 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 關 (見 表 33.1)。在 蛋 白 質 印 跡 系 統 中 ，酶 聯 物過 多 是 導 致 信 號 易 變 、背 景 太 深 、信 號 持 續 時 間 短 及 靈 敏 度 低 的 單 一 的 最 主 要 的 原 因 。
最 理 想 的 信 號 發 射 曲 線 是 緩 慢 衰 減 的 (圖 33. 4 ) , 因 為 這 表 明 系 統 中 的 每 一 組 分 都 達到 了 最 優 化 ，并 能 產 生 可 重 復 的 結 果 。信 號 衰 減 的 太 快 會 造 成 差 異 ，使 得 靈 敏 度 低 及 信 號記 錄 不 足 。持 續 時 間 長 的 信 號 能 最 大 限 度 減 小 因 轉 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 異 。
雖 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 況 下 能 保 持 活 性 ，但 是 隨 著 和 底 物 接 觸 時 間 的 延 長 , H R P也 會 失 活 。在 氧 化 反 應 中 產 生 的 自 由 基 可 與 H R P 結 合 ，這 種 方 式 讓 酶 無 法 再 與 底 物 反應 。系 統 中 過 量 的 H R P 也 會 產 生 大 量 的 自 由 基 ，這增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基還 會 破 壞 抗 原 、抗 體 和 膜 ，降 低 膜 再 標 記 的 有 效 性 。
4.3 蛋 白 廣 印 跡 的 優 化
每 一 個 蛋 白 質 印 跡 系 統 都 必 須 經 過 優 化 以 獲 得 一 致 的 實 驗 結 果 。許 多 因 素 都 會 影 響信 號 的 強 度 和 持 續 時 間 , 每 一 種 因 素 都 可 被 優 化 , 我 們 將 在 以 下 幾 節 中 討 論 。本 章 末 尾 關于 方 案 的 一 節 包 括 了 優 化 步 驟 的 具 體 指 導 和 建 議 。
4.3.1 印跡膜
膜 組 分 似 乎 不 能 影 響 H R P -魯 米 諾 反 應 以 及 后 續 的 信 號 產 生 。然 而 ，硝 酸 纖 維 素 膜和 P V D F 膜 的 確 在 蛋 白 質 結 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 來 說 ，硝 酸 纖 維 素 膜 能 更 好 地 與 蛋白 質 結 合 ，條 帶 更 清 晰 ，有 時 候 靈 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 強 , 不 易 浸濕 ，有 時會 產 生 更 多 背 景 信 號 ，然 而 ，它 具 有 較 大 的 抗 張 強 度 和 良 好 的 操 縱 特 性 。為 獲 得 最 好 的 實驗 結 果 ，需 要 根 據 經 驗 來 確 定 蛋 白 質 印 跡 系 統 最 優 化 的 膜 類 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 證 明某 種 膜 在 系 統 中 有 效 ，最 好 在 整 個 研 究 過 程 中 都 使 用 這 一 批 次 的 產 品 。
4.3.2 靶蛋白
不 同 蛋 白 質 的 轉 移 效 率 有 著 很 大 不 同 。在 特 定 的 設 置 的 條 件 下 ，蛋 白 質 遷 出 凝 膠 的能 力 及 結 合 膜 的 向 有 所 不 同 。轉 移 效 率 依 賴 于 一 定 因 素 ，如 凝 膠 組 分 、凝 膠 與 膜 的 接 觸程 度 、電 極 的 位 置 、轉 移 的 持 續 時 間 、蛋 白 質 大 小 和 組 分 、電 場 強 度 及 是 否 加 人 去 污 劑 。低離 子 強 度 緩 沖 液 和 低 電 流 的 條 件 可 使 大 多 數 蛋 白 質 達 到 最 優 轉 移 。使 用 與 免 疫 印 跡 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 對 膜 進 行 染 色 ，可 評 估 轉 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 見 蛋 白 質 染 料 包 括 : 麗 春 紅 S ,— 種 可 隨 時 間 褪 色 的 紅 色 染 料 ; 考 馬 斯 染 料 ，一 種 可 緊 密 結 合 蛋 白 質 并 干 擾 免 疫 印 跡 的 敏 感 的 藍 色 染 料 ,— 種 簡 單 可 逆 的 藍 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。
4.3.3 封閉緩 沖 液
很 多 不 同 的 封 閉 試 劑 都 對 蛋 白 質 印 跡 有 效 。因 為 沒 有 任 何 一 種 封 閉 劑 適 用 于 所 有 系統 ，故 有 必 要 進 行 檢 驗 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 閉 緩 沖 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 會 與 系 統 中 的 抗 體 或 靶 物 質 反 應 。例 如 , 在 親 和 素 -生 物 素 系 統 中 使 用 5 % 脫脂 牛 奶 作 為 封 閉 劑 可 造 成 高 背 景 ，因 為 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 內 源 生 物 素 , 可 與 親 和 素 蛋 白結 合 。當 變 換 底 物 、抗 體 或 靶 物 質 時 ，僅 僅 因 為 對 于 這 一 新 系 統 封 閉 緩 沖 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 號 減 弱 或 背 景 增 強 。
在 封 閉 緩 沖 液 中 加 人 表 面 活 性 劑 ，如 去 污 劑 T W e e n -20，可 為 某 些 系 統 帶 來 好 處 。表 面 活 性 劑 阻 止 封 閉 試 劑 與 靶 物 質 的 非 特 異 結 合 ，或 將 膜 上 抗 體 可 以 結 合 的 疏 水 位 點 封閉 , 從 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 過 多 的 去 污 劑 會 造 成 封 閉 不 充 分 。通 常 我 們 使 用 終 濃度 為 〇. 0 5 % 的 去 污 劑 。但 是 ，為 了 得 到 最 好 結 果 , 我 們 要 確 定 去 污 劑 是 否 增 強 了 某 個 特殊 系 統 及 確 定 去 污 劑 的 理 想 濃 度 。通 常 使 用 高 質 量 低 污 染 的 去 污 劑 。
4.3.4 抗體
不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 親 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 濃 度 同 樣 對 信 號 強 度 有 很 大影 響 。一 抗 或 /和 二 抗 濃 度 不 當 會 造 成 印 跡 上 H R P 過 多 。采 用 最 小 一 抗 濃 度 比 較 有 利 ，因 為 這 樣 能 推 動 靶 物 質 的 特 殊 結 合 并 降 低 背 景 。
如 果 印 跡 不 能 產 生 足 夠 的 信 號 ，就 將 所 有 的 檢 測 試 劑 從 印 跡 中 移 除 (剝 離），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 體 濃 度 重 新 標 記 ，這 種 做 法 常 常 可 以 節 約 珍 貴 的 樣 品 ，并 且 節 省 時間 ; 然 而 ，不 充 分 的 剝 離 可 使 有 活 性 的 H R P 殘 留 在 印 跡 上 并 產 生 信 號 。將 底 物 加 在 被 剝離 的 印 跡 上 , 隨 后 便 可 檢 測 出 印 跡 上 是 否 殘 留 活 性 H R P 。 同 樣 , 剝 離 無 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 會 抑 制 一 抗 與 靶 物 質 的 結 合 。剝 離 并 重 新 標 記 印 跡 是 一 種 獲 得 特 殊 系 統 相關 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 種 確 定 理 想 系 統 參 數 的 決 定 性 方 式 。
4.3.5 檢 測 方 法
習 慣 上 ，使 用 膠 片 來 檢 測 蛋 白 質 印 跡 的 化 學 發 光 信 號 。它 不 需 要 昂 貴 的 設 備 ，并 能 提供 極 佳 的 靈 敏 度 ，但 卻 只 有 狹 窄 范 圍 的 線 性 檢 測 強 度 。通 常 需 要 調 整 膠 片 的 曝 光 時 間 以得 到 具 可 出 版 質 量 的 印 跡 結 果 ，這 會 消 耗 時 間 并 造 成 浪 費 。將 曝 光 后 的 膠 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 產 品 中 可 以 移 除 曝 光 過 度 產 生 的 額 外 信 號（圖 33.5 ) 。這 些 試 劑 可 以 均 勻 地 移 除 膠 片 中 的 銀 ，在 優 化 膠 片 表 觀 的 同 時 維 持 信 噪 比 。
C C D 照 相 機 及 附 帶 的 分 析 軟 件 可 以 調 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 測 定 。與 膠 片 相 比 ，成像 儀 在 檢 測 方 面 具 有 一 定 優 勢 ，因 其 有 較 大 的 動 態 范 圍 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 沒 有 高背 景 或 高 強 度 信 號 干 擾 數 據 的 情 況 下 盡 可 能 地 完 成 圖 像 記 錄 。此 外 , 理 想 的 曝 光 時 間 可防 止 條 帶 信 號 飽 和 , 并 能 觀 察 到 密 度 的 微 小 變 化 。相 比 較 而 言 ，膠 片 具 有 較 小 的 動 態 范圍 ，條 帶 信 號 也 會 迅 速 達 到 飽 和 。當 信 號 強 度 較 高 時 ，膠 片 的 低 動 態 范 圍 使 其 快 速 飽 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 會 產 生 過 度 曝 光 的 圖 像 。