一、蛋白質印跡法蛋白質印跡 (Western Blotting) 法是在混合的復合物中鑒定和定量特定蛋白質的一種有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。這一技術對固定在硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白質樣本進行非直接的檢測。在常規的蛋白質印跡中，蛋白質樣本首先通過 SDS-PAGE 進行分離，然后電轉移到膜上。在用不相關的蛋白質封閉膜之后 ，用與靶抗原結合的一抗 (多克隆抗體或單克隆抗體) 與膜孵育。接著清洗膜，再用可與一抗發生反應的酶聯二抗孵育。然后再次清洗膜，將其在合適的酶底物中孵育。如果使用比色底物的話, 信號可以目測，如果用化學發光和熒光底物，則 可 利 用 X 射線膠片或成像設備測得信號。 蛋白質印跡方法學中幾個最重要的進步包括高靈敏度增強化學發光底物、成像系統和最近出現的多種見光穩定的榮光劑= 超尚靈敏度的化學發光底物 的廣泛應用幾乎取代了同位素標記的探針的使用。用125I 標記的蛋白質 A 或蛋白質 G 曾一度廣泛用做二級檢測劑，但如今增強化學發光底物就可檢測到低至飛克 (femtogram) 數量級的蛋白質，并且具有高信噪比。 電荷親合元件 (charged-coupled device，CCD) 成像儀在大多數實驗室中都十分常見。成像儀具有較大動態范圍和高程度曝光控制, 這使得背景信號能夠自由調節。此外 ，成像儀所附帶的分析軟件能夠完成光密度分析。盡 管 X 射線膠片仍然應用廣泛且靈敏度更高，但 是 CCD 成像系統卻可以避免處理膠片和顯影的麻煩，并且也不會產生化學廢物。 近 來 ，熒 光 劑 染 料 發 展 迅 速 ，這 要 歸 功 于 新 一 代 熒 光 團 。與 傳 統 熒 光 團 相 比 ，它 們 在亮 度 、光 穩 定 性 及 p H 靈 敏 度 上 有 著 巨 大 的 進 步 。通 過 熒 光 檢 測 的 蛋 白 質 印 跡 檢 測 法 通常 用 于 同 一 印 跡 中 需 要 檢 測 兩 種 不 同 靶 抗 原 時 。而 突 光 團 對 的 選 擇 基 于 它 們 不 同 的 可 區分 開 的 激 發 -發 射 光 譜 。易 辨 別 的 顏 色 差 異 能 夠 使 多 色 檢 測 實 驗 順 利 完 成 。最 值 得 注 意的 是 ，這 些 新 型 熒 光 染 料 結 合 軟 件 的 運 用 ，可 實 現 細 胞 信 號 通 路 的 檢 測 和 定 量(Chou d h a r y et al ,2007；T i p s m a r k et al. ,2008) 二、蛋白質印跡法的種類2.1 直 接 與 間 接 直 接 蛋 白 質 印 跡 法 是 指 利 用 標 記 報 告 系 統 的 一 抗 直 接 與 靶 蛋 白 結 合 。間 接 蛋 白 質 印跡 法 則 利 用 標 記 的 二 抗 (R a m L a U ，1987) 與 未 標 記 的 一 抗 相 結 合（圖 33. I h 由 于 無 需 與二 抗 孵 育 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 比 間 接 蛋 白 質 印 跡 法 耗 時 較 短 。此 外 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 也避 免 了 因 二 抗 交 叉 反 應 所 造 成 的 背 景 信 號（Bergendahl et al. ,2003)。直 接 蛋 白 質 印 跡法 還 可 同 時 探 測 多 種 靶 物 質 。但 是 有 時 在 免 疫 反 應 中 , 標 記 一 抗 會 有 不 利 影 響 ，并 且 即 便在 最 好 的 情 況 ，標 記 過 的 一 抗 也 無 法 進 行 信 號 放 大 。因 此 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 的 靈 敏 度 通常 要 低 于 間 接 檢 測 法 ，并 且 只 能 在 靶 抗 原 豐 度 較 高 時 使 用 。能 夠 放 大 信 號 并 不 使 用 二 抗的 間 接 檢 測 法 稱 為 一 抗 生 物 素 化 。用 生 物 素 化 的 試 劑 標 記 一 抗 通 常 使 每 個 抗 體 分 子 帶 有超 過 一 個 生 物 素 。每 一 個 生 物 素 都 能 夠 和 酶 聯 的 親 和 素 、鏈 霉 親 和 素 或 T h e r m o Scientific NeutrAvidin Protein? 發 生 反 應 。這 些 多 酶 體 系 催 化 了 合 適 的 底 物 的 轉 化 ，以 此 放 大信 號 。基 本 上 ，親 和 素 偶 聯 物 替 代 了 二 抗 , 并 且 其 物 質 的 量 濃 度 和 二 抗 原 本 的 物 質 的 量 濃度 幾 乎 相 同 。但 是 需 要 注 意 , 如 果 用 于 凝 膠 中 的 樣 本 是 天 然 生 物 素 化 的 ，尤 其 是 在 使 用 高靈 敏 度 底 物 時 ，產 生 的 信 號 很 有 可 能 會 干 擾 靶 蛋 白 的 檢 測 。
 2.2 far-Western 有 時 , 針 對 一 種 特 定 抗 原 的 抗 體 在 蛋 白 質 印 跡 分 析 時 并 不 適 用 ，或 者 無 法 獲 得 。然而當 靶 蛋 白 結 合 物 可 充 當 探 針 時 ，印 跡 法 仍 然 可 行 。這 種 類 型 的 應 用 便 稱 為 far-WestemBlot, 通 常 用 于 蛋 白 質 -蛋 白 質 相 互 作 用 的 發 現 或 確 認 。關 于 這 個 主 題 的 變 化 頗 多 ，并 涉及 前 文 所 述 的 所 有 方 法 策 略 。此 時 標 記 過 的 結 合 物 就 相 當 于 一 抗 , 可 通 過 與 35S 體 外 翻 譯反 應 進 行 標 記 。也 可 以 將 探 針 生 物 素 化 ，并 用 親 和 素 或 類 似 親 和 素 的 偶 聯 物 檢 測 ，這樣能夠 更 好 地 放 大 信 號 。必 須 注 意 探 針 不 宜 過 度 標 記 ，因 為 這 會 減 弱 它 與 靶 物 質 的 反 應 能 力 。或 者 ，可 將 帶 標 記 的 重 組 探 針 在 細 菌 中 表 達 (標 記 可 選 擇 G S T 、H A 、c-M y c 或 F L A G ) ，通過 識 別 這 些 標 簽 的 標 記 抗 體 實 現 檢 測（Burgess et aL ,2000)。 2.3 半定量蛋白質印跡法 通 常 認 為 蛋 白 質 印 跡 法 是 定 性 的 ，但 當 加 入 特 定 對 照 時 ，它 也 可 成 為 一 種 定 量 方 法 。當 E L I S A 無 法 用 于 某 種 樣 本 ，或 是 當 生 物 樣 本 中 的 某 種 組 分 會 干 擾 E L I S A 時 , 半 定 量 蛋白 質 印 跡 法 便 表 現 出 其 優 勢 。一 般 來 說 ，針 對 某 種 蛋 白 質 的 抗 體 也 能 對 與 這 種 蛋 白 質 密切 聯 系 的 蛋 白 質 表 現 出 同 等 專 一 性 。在 這 種 情 況 下 ，E L I S A 會 產 生 假 陽 性 或 過 高 估 計 了
靶 蛋 白 豐 度 。 由 于 蛋 白 質 印 跡 法 需 要 用 凝 膠 電 泳 分 辨 蛋 白 質 ，分 子 質 量 間 的 差 異 可 以 用來 單 獨 區 分 和 定 量 粑 蛋 白（Sato et al. ，2002;Xing and I m a g a w a , 1999)。 為 了 評 估 定 量 蛋 白 質 印 跡 法 的 有 效 性 和 準 確 性 ，我 們 要 用 純 化 的 靶 蛋 白 作 為 內 對 照 ，繪 制 出 標 準 曲 線 。樣 本 必 須 含 有 足 夠 量 的 靶 蛋 白 ，使 其 量 控 制 在 標 準 曲 線 范 圍 之 內 。可借 助 C C D 照 相 機 和 成 像 系 統 對 蛋 白 質 印 跡 進 行 光 密 度 分 析 ，將 條 帶 強 度 轉 化 為 定 量 尺度 。最 后 用 E L I S A 驗 證 蛋 白 質 印 跡 法 測 出 的 曲 線 趨 勢（M a t h r u b u t h a m and V a t t e m ，
2005)。 2.3.1 檢 測 方 法
 SuperSignal① W est Dura 底 物（Thermo Fisher Scientific) 檢測信號。用 Kodak 20000 MM成 像 站 成 像 ，并 用 成 像 站 附 帶 的 印 跡 密 度 分 析 軟 件 分 析 蛋 白 質 條 帶 密 度 。定量蛋白質印跡數據可通過 P5 3 和 的 ELISA 實驗進行驗證 (Assay Designs,
Arm Arbor ,M D，根據制造商說明書完成 ELISA。 2.3.2 結 果 及 討 論 蛋 白 質 印 跡 的 光 密 度 分 析 表 明 ，L B a 的 線 性 范 圍 為 0?097? 3.12 n g ，p 5 3 的線性范圍為 1. 87? 60 n g 。在 這 個 范 圍 內 提 供 了 極 佳 的 陽 性 內 對 照 ，并 能 抵 消 蛋 白 質 印 跡 法 效 率的 差 異 。 在蛋白質印跡分析中，在 用 E G F 處 理 后 的 前 5 m in 內 IkBc 1 的水平保持恒定，但在30 min 后迅速降低 3 0 % ，最后, 在接下來的 24 h 內逐漸上升（圖 33.2)。蛋白質印跡光密度分析表明，P5 3 水平在用 D ox 處理后的前 8 h 變化很小，在 這 之 后 的 20?30 h 迅速上升 。若 用 C is 處 理 ，p 5 3 水平則在 30 h 內逐漸上升 (數據未顯示）。
 LcBa ( 圖 33.2 ) 和 P5 3 水 平 變 化 趨 勢 可 用 E L IS A 驗 證 ，并 和 已 發 表 的 數 據 一 致(K w ok et a l .，I 9 9 4 5Sun and Carpenter，1998)。在 p53 的實驗 中 ，盡管通過蛋白質印跡法得出的數據已被 ELISA 所驗證，但是，仔細比較這些數據可以發現，在 20?30 h , 蛋白質印跡對 P 5 3 的數量變化更為靈敏。在 20?30 h 存在著大量 P5 3 , 但 是 E L ISA 無法檢測出這段時間中 P 5 3 正在逐漸增加，而蛋白質印跡法卻可以做到。相 反 , 在 前 8 h 內，p 53
水平相對較低，E L IS A 比定量蛋白質印跡法更能較好地檢測 p5 3 的變化。 雖然蛋白質印跡法和 E L IS A 同屬免疫檢測法，但其應用各異, 且通常所用的免疫試劑也有所不同。絕對蛋白質數量差異的產生大抵是因為用于對照組、一抗特異性的重組蛋白有所差異, 以及每種技術中蛋白質的相互作用各不相同。 三、檢測方法3.1 酶聯物 堿性磷酸酶 (A P，l 4 0 kDa) 作為曾經的首選酶，通常可用做沉淀顯色的底物。比色反應以穩定速率進行，這使相關靈敏度和反應進程能得到精確控制。隨著蛋白質研究的發展 ，H R P(40 kDa) 變得更為流行，因其穩定性好，分子質量更小。這些特性就能使每個Ig G 結合更多的 H R P 分子 ，靈敏度也就更強。此 外 ，用 于 H R P 的化學發光底物還能進一步提 f t 靈敏度。 3.2 比色檢測法 比色或顯色底物或許是最簡便也是最劃算的檢測方法。當與合適的酶接觸時, 這些底物便轉化為不溶的有色物質沉淀在膜上，無 需 特 殊設備便可處理或觀測。底 物 ，如3 ，3’，5，5’-四甲基聯苯胺 (TMB)、4-氯-1-萘酚 (4-CN) 和 3,3’-二氨基聯苯胺鹽酸鹽 (DAB)與 H R P — 同使用。 A P 的底物包括會形成不溶濃紫色沉淀的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-P -甲苯胺鹽 (BCIP)、氯化氮藍四唑 (NBT) 和 Fast Red(萘酚 AS-M X 磷酸鹽+ F a s t Red TR鹽）。從不同供應商處購得的同種底物差異可能會很大, 這是因為底物的濃度和純度、添加物及緩沖成分都會影響實驗結果。 3.3 熒光檢測法 借助熒光檢測的蛋白質印跡法通常用于同一印跡中有兩種不同靶物質和需要高靈敏度的實驗中。熒光染料 (通常稱為「熒光團」,即「fluorophore」或簡稱「fluor」) 是一種特殊分 子 ，它在某一波長吸收一個光子能量時化學鍵被激發，回到基態時能發射出一個波長大于吸收光的光子。化學性穩定, 具有合適范圍的高效 (強烈) 激發和發射波長的小分子熒光團可用于檢測抗體的化學標簽或標記，以及其他生物分子探針。 一些基于熒光劑的系統使用熒光蛋白（如藻紅蛋白）或生物發光報告系統，但是這些方法十分耗時，在檢測多種靶物質時具有局限性, 并且通常不具有人工合成熒光染料那樣的 光 穩 定 性 和 靈 敏 度 。利 用 精 選 的 熒 光 染 料 組 所 標 記 的 特 定 探 針 ，熒 光 技 術 實 現 了 多 種靶 物 質 的 探 測 , 并 適 用 于 更 多 型 號 的 熒 光 設 備 。 盡 管 熒 光 黃 、羅 丹 明 和 氨 基 甲 基 香 豆 素 乙 酸 鹽 (A M C A ) 染 料 是 傳 統 的 熒 光 團 ，它們者 IS 具 有 許 多 局 限 性 。特 別 是 這 些 傳 統 染 料 具 有 相 對 較 低 的 熒 光 強 度 ，容 易 發 生 光 漂 白 。新 一 代 的 熒 光 團 克 服 了 這 些 局 限 性 (表 33. 1 ) ，并 且 在 亮 度 、光 穩 定 性 和 p H 靈 敏 度 方 面都 有 巨 大 的 改 進 。這 些 新 型 熒 光 團 可 覆 蓋 整 個 可 見 光 譜 及 大 部 分 的 紅 外 線 光 譜 。
 當 進 行 焚 光 蛋 白 質 印 跡 實 驗 時 , 通 常 選 擇 弱 熒 光 (處 理 的 ) 膜 ，因 為 膜 聚 合 物 在 光 譜 可見 范 圍 內 的 自 發 熒 光 會 對 檢 測 造 成 干 擾 。鑒 定 靶 物 質 時 ，選 擇 激 發 -發 射 光 譜 不 重 疊 的 熒光 劑 是 十 分 關 鍵 的 。一對 典 型 的 熒 光 劑 包 括 T h e r m o Scientific Dy L i g h t ① Fluors 549 和T h e r m o Scientific DyLight Fluors 649 或 是 D y Light Near-infrared (I R ) Fluors 680 和DyLight Near-infrared (I R ) FIuots 800。 近 紅 外 線 熒 光 劑 十 分 有 用 ，因 為 蛋 白 質 樣 本 和膜 聚 合 物 的 自 發 熒 光 不 太 可 能 出 現 在 這 些 光 譜 范 圍 中 , 從 而 可 以 實 現 更 低 的 背 景 和 更 高的 靈 敏 度（Patonay and Antoine,1991;Sowell et al. ,2002)。 3.4 化學發光檢測法 最 常 用 的 蛋 白 質 印 跡 法 底 物 是 基 于 魯 米 諾 的 底 物 ，該 底 物 能 夠 產 生 化 學 發 光 信 號 。化 學 發 光 是 一 種 能 夠 產 生 光 形 式 能 量 的 化 學 反 應 (圖 33. 3)。魯 米 諾 在 H R P 和 過 氧 化 氫緩 沖 液 存 在 下 被 氧 化 ，形 成 一 種 處 于 激 發 態 的 產 物 , 從 激 發 態 衰 退 至 基 態 時 能 發 出 光 。光
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