(一)蛋白質電泳
1.請參照常規電泳操作.
2.分子量標準:
可選擇普通分子量標準或預染的分子量標準.在選擇預染的分子量標準時,要注意其優點和缺點:
優點: 在電泳過程中可監控蛋白質分離狀態; 可指示轉印中蛋白質的轉印效率.
缺點: 染料影響蛋白質移動速度;分子量測定略欠精確;影響蛋白質與膜的結合力.
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(二)蛋白質轉印
a) 膜的選擇:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比較如下:
(尼龍膜和NC膜的特點相似,主要用于核酸雜交)
b) 膜的大小: 請根據膠的面積來確定.
c) 膜的孔徑: 0.45um適用一般蛋白質. 0.2um適用小分子蛋白質.
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(三) 蛋白質的顯示(大部分實驗不需要進行此步操作)
蛋白質染色的染料有很多種,各種的特點均不一樣.
(四)免疫檢測
有各種不同的免疫檢測方法.請注意選擇.方法不同,則所需的試劑也不同.如需方便,可選擇完整的試劑盒.
A.封閉膜:
這一步會影響結果的成敗和背景的強度.常用封閉劑為BSA和Tween20. 脫脂干奶粉不適合用于糖蛋白和生物素標記抗體.
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B.一抗: 根據目的蛋白質選擇.單抗或多抗均可.注意已變性蛋白質無法檢測,必須采用非變性膠電泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原裝抗體或進口分裝抗體.具體請參見免疫學部分產品----第一抗體.
C.標記二抗: 根據一抗的來源選擇二抗.
購買信息: 請參見免疫學部分試劑---各種標記抗體
D.底物系統: 采用常規底物或化學發光底物.
(1) 顯色法: 常用底物為BCIP/NBT或DAB .此法簡單,但靈敏度不高,并難以從膜上去除.
(2) 化學發光法: 目前比較常用的方法.靈敏度較高,檢測時可采用X光膠片或CCD成像系統.
不同顯色方法產品比較如下: