一、提取抗原蛋白
將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl異丙醇, 混勻, 靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min, 棄上清, 加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸沉淀, 用加樣器打散沉淀, 混旋20~30秒, 靜置20min(RT) , 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清 , 重新加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精兩次, 重懸沉淀, 離心后棄上清, 加入100% 無水乙醇 1ml, 混旋1min, 靜置20min(RT), 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃熱水助溶，直至全部溶解。10000×g, 離心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各樣品10 ul，加DW 990 ul
2. 取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標準濃度0.5 ml。
3. 向各管加入2.5 ml D試劑（A50ml＋B0.5ml＋C0.5ml A－2%[陳星云1][陳星云1]Na2CO3、0.1N NaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸鈉）混勻，靜置10分鐘。
4. 迅速加入酚試劑0.25ml，混勻 37℃ 水浴30分鐘。
5. 721分光光度計650 nm，比色，S0標準管調零。
6. 最后稀釋為4 ug /ul，加載樣緩沖液后，終濃度為2ug / ul，上樣量為30～80ug / 泳道。
三、電泳
1. make gel．
11%分離膠 12ml 兩塊膠 | 4%積層膠6ml兩塊膠 |
DW 4.36 ml | DW 堵漏 3.66ml |
3M Tris 3.0 ml | 0.5M Tris 1.5 ml |
30%Arc 4.4 ml | 30%Arc 0.5 ml 0.78 ml |
10%SDS 0.24 ml | 10%SDS 60 ul |
10%APS 0.12 ml | 10%APS 20ul 30 ul |
TEMED 10ul | TEMED 5ul 6ul |
2. 上樣前樣品處理：
樣品100℃、3分鐘、冷卻，900×g、離心30 S。
3. 通電電： 積層膠電泳電壓50V左右，分離膠電泳電壓90～110V。
4. 考馬斯亮藍染色： 1小時，1號脫色1小時，2號脫色2小時。
四、電轉印
1. 將濾紙NcM切成與凝膠尺寸大小，置于DM中浸透5分鐘，電轉液平衡15分鐘。
2. 轉移：用二張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將NcM、膠夾于中間，在NcM與大濾紙之間墊小濾紙。NcM朝正極，20V恒壓轉移12小時。取下NcM雜交，凝膠染色看效果。
五、雜交
1. 取下NcM，做好標記，dH2O沖洗，室溫濾紙干或放入膜固定液15分鐘。
2. NcM用PBS沖洗二遍，呈5～6% non－fat milk的pH7.2的PBS中封閉，室溫 ６－８小時或室溫1－2小時，4℃，過夜。
3. 將封閉的膜用ＰＢＳ沖洗一遍，洗15分鐘×1，5分鐘×2。
4. 加入一抗 1:1000－1200，室溫，反應1小時
5. PBS洗15分鐘×1，15分鐘×4。
6. 加入二抗 1:5000，室溫，反應1小時。
7. PBS洗15分鐘×1，5分鐘×4。
六、化學發光試劑檢測
1. 混合等體積Bottle1&2與NcM共孵育1分鐘。
2. 放射自顯影：曝光3分鐘至10分鐘。
3. 顯影后清水漂洗，再定影。
七、所用試劑
1、勻漿緩沖液 4×1L：
NaH2PO4（·H2O） | 12.48g |
Na2PO4·12H2O | 114.6g |
NaCl | 3.6g |
dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L |
（1）用時稀釋4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白濃度稀釋法：
取500ug / ml BSA按下法配制：