Westernblot如何進行實驗質控？

WB實驗總做不好，那么如何進行WB實驗質控呢？

做過WB實驗的小伙伴都經歷過成像時忐忑不安，出來結果時的彷徨無措，為什么條帶沒有出啦，為什么背景這么高，為什么受傷的總是我，看著旁邊小伙伴漂亮的結果圖，心生羨慕嫉妒，那么小編給大家整理總結了如何進行WB的質控和注意哪些檢查點。

蛋白樣品：

準備好裂解液后，使用BCA或Bradford等檢測方法仔細測量蛋白濃度。進行上樣時，確保加入等量的蛋白樣品，以確保公平比較，從而最大限度地減少上樣誤差。不要使凝膠過載！如果您的表達目標非常低，可選擇加樣孔體積大的凝膠，這樣可提高上樣量。

陽性和陰性對照：

這些質控對于證明您的結果有效至關重要。陽性對照通常是裂解物或組織提取物，其具有過度表達的蛋白。當您的陽性對照未能發出信號時，您知道該方法可能存在問題。如果您正在使用重組蛋白，那么包含內源形式靶標的陽性對照也是一個好主意。這將有助于理清與一抗相關的任何特異性問題。陰性對照同樣也有價值，通常是不會產生目標的裂解物或組織提取物。最好的陰性對照由敲除或未處理的細胞系制備。

內參對照：

有幾種廣泛可用的上樣對照抗體，如GAPDH，actin 或 tubulin。由于這些蛋白表達豐度高，因此在適應低豐度目標的樣品表達看到內參對照蛋白的過飽非常常見。這里最大的挑戰是內參對照和靶蛋白在相同的樣品稀釋系列中通常具有不同的線性，影響定量的準確性，對于目的蛋白表達比較低的蛋白，可選擇低表達的內參例如Lamin B1和HSP60等蛋白。此外，研究人員需要證明內參蛋白的表達不會因實驗條件的變化而改變。

在第一個檢測線性范圍重疊的地方，蛋白質在該重疊區域內的定量將是很好的。然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強度，而不影響另一種蛋白質的條帶強度。在這種情況下，定量是不準確的。

轉移效率/總蛋白標準化：

轉印完成后，最好評估轉移到膜上的蛋白量以及凝膠中剩余的蛋白量。通過評估整個蛋白范圍，產生更廣泛的動態范圍。這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。例如AzureRed熒光蛋白染色是一種用于凝膠和印跡膜的定量總蛋白染色試劑，與下游蛋白分析兼容。AzureRed是染色應用的理想選擇，包括轉印后染色以確認從凝膠到膜的蛋白質轉移情況，以及定量蛋白。執行這些檢查不僅可以讓您對實驗的進展充滿信心，現在很多期刊雜志都推薦使用總蛋白定量的方法來進行質控，以證明數據的可重復性和準確性。

     圖1. AzureRed與三種感興趣的蛋白同時成像

向凝膠中加入稀釋的HeLa細胞裂解物。轉印后，將印跡用AzureRed染色，然后在不脫色情況下加入tubulin，?-actin和GAPDH探針。用Azure Sapphire 雙模式多光譜激光成像系統掃描成像。四個通道進行疊加，總蛋白質（AzureRed染色）以灰色顯示;tubulin-紅色，?-actin-藍色和GAPDH-綠色。

不加入一抗：

這是一個簡單但經常被遺忘的WB印跡控制。通過僅僅加入二抗孵育印跡，您將能夠清楚地看到由于實驗中使用的二抗而產生非特異性的條帶。

通過小編的介紹，做好質控，相信您的WB數據也是妥妥的。