Wnt
/β-catenin信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在正常的體細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發揮作用。只有當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合激活胞內的d
ishevelled(散亂的)蛋白導致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運 ,
β-catenin才能在胞質中積累起來。
當胞質中B-catenin的濃度達到一定水平時,
就可向細胞核轉移。在胞核中β-caten in與轉錄因子家族Tcf /Lefs結合, 可激活cyc linD1
和cmyc等原癌基因而導致細胞的增殖、分化、成熟。顯然， 在這條信號通路中β-catenin 發揮了重要作用,其在胞質中積累繼而向胞核的轉位,
被認為是該信號通路被激活的標志。已有研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在人結腸癌、乳腺癌等腫瘤的發生中被激活，但是有關該信號通路在肝癌,
特別是在模型鼠肝癌發生中的作用卻少有報道。
本研究中通過建立大鼠的肝癌模型，以Wnt
/β-ca ten in 信號通路中的幾個關鍵因子為研究對象，
探討它們在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和腫瘤肝臟中的表達，以期揭示Wnt/β-catenin信號轉導通路與肝腫瘤發生的關系，為臨床上肝癌的診治提供新的線索。
1 材料和方法
1. 1 材料
兔抗β-
caten in及抗APC 抗體購自武漢博士德生物技術公司。鼠抗cyclin D1
mAb以及PV6001兩步法檢測試劑盒購自北京中杉生物技術公司。總RNA 提取試劑盒(W6701)購自上海華舜生物工程有限公司。逆轉錄試劑盒(
Reve rtA id HM inus F irst Strand cDNA Synthesis K it) 購自Fermentas公司。PCR
反應試劑盒( DRR01AM ) 購自TaKaRa 公司。50只雄性SD大鼠, 體質量150~ 180 g，由四川大學實驗動物中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 大鼠肝癌模型的建立
參照鄭杰等[報道的方法,將二已基亞硝胺(
DENA)的水溶液以70 m g /kg的劑量每周灌胃1次,
15周停藥。有10只大鼠在造模過程中死亡，其余32只分別在喂藥后第1、4、6、8、10、12、14、16周，處死動物，每次處死4
只。每只取不同部位的小塊肝組織，分別置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮凍存。正常對照組8只，不給藥。
1. 2. 2 wn t1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及c-m yc mRNA 的RT-PCR 檢測
引物的設計和合成交由大連寶信生物公司完成，經驗證后使用。
擴增wn
t1 基因的引物序列為: 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG
ACC-3，擴增產物長度為432 bp，退火溫度為58e 。擴增β-caten in基因的引物序列為: 5-AAG TTC TTG GCT
ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，擴增產物長度為375 bp, 退火溫度為58. 2e 。
擴增APC 基因的引物序列為: 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，擴增產物長度為310 bp，退火溫度為60e 。
擴增cy clin D1基因的引物序列為: 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，擴增產物長度為440 bp， 退火溫度為58e 。
擴增cmyc基因的引物序列為: 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，擴增產物長度為186 bp，退火溫度為60. 5e 。
擴增內參照B-actin引物的序列為5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，擴增產物的長度為665 bp， 退火溫度為60e 。
總RNA
的提取和cDNA 第1 鏈的合成嚴格按照相應的試劑盒中的說明操作。PCR反應條件為: 94e 預變性2 m in， 94e 變性30
s，退火( 依據不同的引物選取不同的溫度) 30 s，72e 延伸30 s共進行28個循環后，再于72e延伸5 m
in。以預先擴增B-actin基因來證明反轉錄模板的有效性，并且確認擴增未到平臺期，在半定量PCR 反應中對其進行平行擴增作為內參照。
PCR產物經10
g /L瓊脂糖凝膠電泳，并以EB染色后，采用IBM 586計算機控制的G el Do c1000成像系統(
Bio-Rad，USA)進行圖像掃描和分析。mRNA 含量的計算: 用圖像分析儀對電泳結果進行掃描， 測定各條帶的A 值，將樣本條帶的積分A
值與相應的B-ac tin mRNA條帶的A 值相比較，即為樣本mRNA的相對含量。
1. 2. 3 β- ca ten in、APC和cyc lin D1表達的免疫組化染色檢測
采用PV6001快速兩步法進行免疫組化染色, 抗原修復采用微波法， 以0. 01 mo l/L的PBS液替代一抗作為陰性對照。β-caten in染色結果的判斷標準，參照文獻報道的方法, 從細胞膜、細胞質和細胞核3 個方面來判斷其表達的差異性。APC表達的位置在細胞質，cyclin D1表達在細胞質和/或胞核。