放射免疫分析法原理及操作注意事項

放射免疫分析的原理：就是利用放射性核素標記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結合，形成抗原抗體復合物的原理來進行分析的。它又分為兩種方法。

一、競爭性RIA，又稱傳統RIA

主要特點：標記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標記抗原Ag +已知定量抗體Ab標記抗原與抗體復合物AgAb+未知抗原與抗體復合物Ag Ab+游離標記抗原Ag （去除）（未知抗原多，標記抗原與定量抗體結合的復合物就少，表現為負相關）。

臨床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），鐵蛋白（Fer），人絨毛膜促性腺激素p亞單位（HCG-13）等的檢測都是競爭性RIA法原理。競爭性RIA法，根據加樣順序與溫育次數的區別，反應方式分三種：平衡法，將非標記抗原（被測物與標準品）、抗體、標記抗原依次加入反應管，混勻后一次性溫育至反應達到動態平衡，再加分離劑分離B（復合物）與F（游離物）如：AFP，8 一MG，Fer；順序加樣法，先將非標記抗原（被測物與標準品），與抗體在反應管內作第一次溫育，待反應達到動態平衡后。加入標記抗原，再作第二次溫育后，分離B與F如：CEA；急診檢測法：為臨床急需檢測結果而提出的反應方式，不等RIA 反應達到動態平衡就終止反應；分離劑的選擇有，PEG（聚乙二醇），第二抗體等。

現在一般采用的是：第二抗體與PEG合用的方法，稱為雙抗體一PEG法。

PEG原理：PEG濃度達到7 一9 時能使抗原一抗體復合物沉淀。

優點：經濟，簡便，通用。

缺點：重復性差，非特異性結合率高。

第二抗體：第一抗體是可與被測抗原進行特異結合的抗體，來自家兔或豚鼠。用第一抗體為抗原，作用到羊，馬身上，產生的抗第一抗體的抗體稱第二抗體。第二抗體與第一抗體在適當條件下發生特異性結合，生成分子量很大的免疫復合物（AgAb ×Ab ），能自然沉淀。

優點：分離效果好。非特異性結合率低。

缺點：增加經費投入。需要第二次溫育，延長了時間。

所以就產生了兩者合用的雙抗體一PEG法，它結合了上述兩種方法的優點。

二、非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（IRMA）

主要特點：標記的是抗體。

按反應原理分為兩種：

（一）單位點IRMA

其原理：抗原只有一個抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（負相關）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；雙位點IRMA：抗原有兩個抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結合時互不干擾ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（過剩的，游離的）：（ImAd—Ab）固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗體。
（二）雙位點IRMA，又稱雙抗體夾心法

從加樣測定順序上看，有三種方法：固相抗體先與未知抗原結合，再與標記抗體結合（正向兩步法）。然后去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體復合物的放射性計數；未知抗原先與標記抗體結合，再與同相抗體結合（反向兩步法）。然后去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體復合物的放射性計數；未知抗原與固相抗體和標記抗體同時反應（一步法，又稱同時加樣法）。然后去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體復合物的放射性計數。
這三種方法都生成夾心狀的抗體一抗原一抗體復合物，故又稱雙抗體夾心法。

糖類抗原CA50，CA125就用的是其中的第三種方法（一步法），血清中的未知抗原與固相抗體和標記抗體同時反應，生成夾心狀的抗體一抗原一抗體復合物，然后去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體復合物的放射性計數。

三、RIA法的影響因素

pH和離子強度；反應溫度，溫度一般為37℃，也有45℃，室溫，4℃ 冰箱；反應時間，操作中的注意事項：戴手套、防護鏡等，將試劑盒從冰箱中取出，室溫下放置30 min方可使用。

（1）編號：第一排是標準管：根據標準品濃度由低到高A，B，C，D，E，F，G……；第二排是被測樣品1，2，3，4，5，6，……。

（2）加樣要準確，移液器的使用（兩個檔位，一檔吸人，二檔排出）吸頭（一個標本一個吸頭，避免互相污染）。加試劑：先看瓶簽，再搖勻，最后吸人。（標記物一般為紅色，一抗為蘭色）。

（3）溫育時間要保證：按說明書中所要求的時間溫育，可以延長，不能縮短。

（4）分離劑加入：混勻靜置時間，可以延長，不能縮短。保證抗原抗體復合物與第二抗體的充分結合。

（5）溫度：注意觀察水浴箱的水溫，誤差不能太大，為±1℃ ，室溫21℃左右。

（6）離心時間：也應按說明書中所要求來操作，轉速一般為3 500r/min。往離心機里放反應管時，盡量讓它直立（因為傾斜可能會使液體流出）。吸上清液時，沉淀物在試管底部，真空泵的吸頭頭部不能直接插人到試管底部中央（會吸走沉淀物，而我們的目的是分離保留沉淀物），應該使吸頭貼著試管管壁往下放，并且試管要稍微傾斜，但要在即將插到沉淀物邊緣時停止，快速上升取出。少留一點點上清液也可。主要是保證沉淀物完整。

（7）進人免疫計數器測量時，注意觀察做出的曲線好壞：是不是需要修改，剔除壞點。

（8）報結果：碰到異常結果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者情況如何，結果是否與患者情況相符，方可報出。非競爭性RIA法中，清洗固相包被珠時，清洗次數要嚴格按說明書中所要求來操作，不得減少。雖然RIA法的影響因素很多，但操作中只要注意上述事項，RIA法的穩定性還是相當不錯的。主要是它存在放射污染，這個問題不易解決，影響了它以后的發展，如今電化學發光免疫分析，化學發光免疫分析，酶聯免疫分析，磁酶免疫分析等相繼推出，發展很快。 RIA法將被淘汰。

參考文獻：

（1）程紹鈞，余裕民.檢驗核醫學[M]。重慶：重慶大學出版社，2003，62—75