從2013年1月份開始到現在，近2年的時間里，CRISPR/Cas9技術的應用領域被來自全球優秀的科學家們不斷的擴大。其中包括基因敲除，定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位和CHIP等多個領域，而且這個技術的應用領域還在不斷的被擴大。
筆者基于多年的基因重組經驗（系統的研究過ZFN / IOS / TALEN / CRISPR重組技術），以及采用CRISPR/Cas9技術構建超過50多個株系的經驗，重點談一談構建敲除細胞株系時，如何利用好CRISPR/Cas9技術。
相比于其它重組技術，使用CRISPR/Cas9技術做基因敲除是效率最高，成本最低的技術。其中的關鍵因素無異于下面幾點：
1) 明確需要敲除的基因序列
首先需要明確內含子和外顯子序列；可以登錄NCBI或者UCSC的網站可以方便的查到；
2) 合適的靶位點選擇
一般建議設計2-3條，然后轉染到細胞中，用Cruiser? 和測序的方法驗證哪個靶位點的活性最好；也可以登錄經過體內活性驗證的CRISPR/Cas9敲除載體庫，根據自己所要研究的基因選擇相關載體。如若沒有，可以定制（可見本文章來源）；
3) 敲除載體選擇
根據需要可以選擇空載體，帶抗性的載體（Puro/Neo），帶熒光標記的載體（EGFP/RFP），雙敲除載體等。其中空載體較小（8K），可以提高轉染的效率；抗性便于后面進行抗性篩選，熒光標記的載體便于進行流式分選；
4) 單細胞生長
不同的細胞單個細胞的生長情況不一樣。有的細胞長的快，有的細胞長的慢，有的單個細胞幾乎就不長。這個就需要采取不同的方案了，這里推薦一個單細胞培養的小耗材：Cell Plaza?。設計精巧，采用的是共培養的原理，如果碰到不好長的單個細胞，可以試一試。同時，這個對于植物細胞做敲除時的小愈傷的生長很有幫助。從事植物基因敲除方向的研究人員，也可以試一試；
5) 陽性克隆篩選
關于這個部分可以參考之前發的一個專稿：《陽性克隆篩選方法匯總》
除了敲除外，CRISPR/Cas9還可以應用在定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位等各個方向，每個方向都有不同的細節需要把握。這里就不一一闡述，如果需要了解更多其它信息，可以隨時和我們聯系。