Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系統采用M-MLV反轉錄酶的RNase
H缺失突變株取代AMV反轉錄酶，使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶，cDNA第二鏈合成采用置換合成法，采用
RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進行置換合成，最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡便易行。該系統試劑包括：
20μg 特異性引物
200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃時); 375mmol/l
KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP， dCTP， dGTP，
dTTP混合物(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA酶抑制劑
10，000μ M-MLV反轉錄酶， RNase H-
5μg 對照RNA
400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：
400mmol/L Tris·Cl ，pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
500μ RNase H
500μ DNA聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
2×1.25ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40μg mRNA。
（一） 第一鏈合成
1. 試劑
[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。
2. 操作步驟
(1) 取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和適當引物，每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭，使用0.3μg)，用H2 O調整體積至15μl， 70℃處理5分鐘，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次加入。
5×第一鏈緩沖液 5μl
rRNasin RNA酶抑制劑 25U
M-MLV(H- )反轉錄酶 200U
H2O調至總體積25μl
(2) 用手指輕彈管壁，吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時
(4) 取出置于冰上
(5) 摻入測定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應，并使總體積為100μl。可取90μl進行電泳分析(先用苯酚抽提)，另10μl進行同位素摻入放射性活性測定。
(6) 第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成
注：以上25μl反應總體積中所用RNA量為1μg，如合成5μg RNA，則可按比例擴大反應體積， 倒5μg RNA使用125μl總體積進行合成。
（二） 第二鏈合成
1、 取第一鏈反應液 20μl， 再依次加入
10×第二鏈緩沖液 20μl
DNA聚合酶Ⅰ 23μ
RNase H 0.8μ
H2O 加至終體積為100μl
2、輕輕混勻，如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定，可取出10μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA， 則需延長至3-4小時)。
4、 摻入測定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA， 取10μl進行同位素摻入放射性測定，余下的可進行電泳分析。
5、 cDNA第二鏈合成離心管反應液70℃處理10分鐘， 低速離心后置冰上。
6、 加入2μ T4 DNA聚合酶， 37℃溫浴10分鐘。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應。
8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應液，離心2分鐘。
9、水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉，pH5.2)， 混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃)， -20℃放置30分鐘后離心5分鐘。
10、 小心丟去上清液，加入0.5ml冰冷的70%乙醇，離心2分鐘。
11、 小心移去上清液，干燥沉淀。
12、 沉淀溶于10-20μl TE緩沖液。
（三）同位素摻入放射性活性測定、計算和電泳分析
1. 試劑
1mg/ml鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA， 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（30mM NaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍）。
2. 操作步驟
(1) 各取一2(5)中和二(4)反應液各3μl，點于玻璃纖維濾紙，室溫干燥， 這些樣品代表總放射性活性。
(2) 同樣各取3μl中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中，混勻，加入0.5ml 5% TCA， 渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。
(3) 用玻璃纖維濾紙過濾，用冰冷的5% TCA洗三次，每次用5ml TCA，再用5ml丙酮或乙醇漂洗， 這些樣品代表摻入放射性活性。
(4) 分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度，可用蓋革計算器，也可用液閃計數。