實驗步驟
##一、 cDNA 宏陣列的樣品制備
培養基： I : 2 (V7 V ) Gamborg B5 培 養 基（GibcoBRL， Rockville, MD), I : 1000(V /V ) Hyponex肥 料（Hyponex 10 : 5 : 10; Hyponex Japan, Osaka， Japan), 1 % 鹿糖 ； pH調 至 5. 7。
##二、 cDNA宏陣列探針制備（見注釋 1?4)
1.4 mol/L 硫 氫 酸 胍（guanidium thiocyanate) 溶 液 ： 4 mol/L 硫氧酸胍， 0 ?1mol/LTris-HCl, p H 7. 5， l0mmol/L E D TA , 0 . 5 % 十二焼基肌氨酸鈉， 0.1%β-疏 基 乙 醇
2.酸 -氯 仿（Phenol-chloroform): 50% (V. V ) 液態酚， pH 8.0， 4 8 % (VvV ) 氯仿， 2 % (V/V ) 異戊醇。
3.5.7 mol /L[氯化銫墊層： 5.7 mol/L氯化銫， 0.1mol/LEDTA,pH調至7.5。
4.DEPC 水 ： 0 . 1 % 焦碳酸二乙酯（DEPC)。
5.10X 雜交液： 1.2 mol/L NaCL 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0， 50 mmol/L EDT A , 1 0 % 十二烷基磺酸鈉（SDS)。
6.BPB溶液： lOmmol/LTris-HCl， p H 7.5, 0.25% 溴酚藍， l mmol/L E D TA ，pH 8.0, 6 0 % (V/V) 甘油。
7.堿溶液： 0. 5 mol/L NaOH， I.5 mol/L NaCl。
8.中和液： I.5 mol/L NaCl， 0. 5 mol/L Tris-HCl; pH 調至 7. 4。
9.2XSSC: 300 mmol/LN aCl， 30 mmol./L 檸檬酸鈉。
##三、 cDNA宏陣列雜交
1.5 XM-MLV RT 緩沖液： 250 mmol/L Tris-HCl， pH 8.3, 375 mmol/L KC1，15 mmol/L MgC^ 0
2.不含 dCTP 的 dNTP 混合液： 20 mmol/L dATP， 20 mmol/L dTTP， 20 mmol/L dGTP。
3.雜 交 液（Church 磷酸緩沖液）： 0.5 mol/LNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,1mol/L EDTA，1μg/mL poly dA (Roche Diagnostics， Indianapolis， IN)， 7 % SDS， pH 調至 7. 2。
4.0.2 XSSC: 30 mmol/L NaCl， 3 mmol/L 梓樣酸鈉。
##四、方法
###1 cDNA宏陣列的樣品制備
（1）選 用 擬 南 芥 戶 sis Heyhn accession Columbia ( Col-O;
ABRC， Columbus， OH)。
（2）用來構建cDNA 文庫的植株在22°C下按照16 h 光 照 ： 8 h 避光的周期進行土壤培養。
（3）生長2?6 周的植株收集地上部分，包括花苞和綠色果莢。植株的水培養是把消毒后的種子散布入培養基，在 22°C下進行不間斷的光照和旋轉培養2 周。水培養的植株收集幼苗和根。
（4）為提取mRNA，先把植株在石棉塊上萌發，并 在 25°C , 5 0 % ?6 0 % 相對濕度，100 pmol HT2 s-1光量子通量密度（PPFD)， 14 h 光 照 ： 10 h 避光周期的條件下在葉箱中培養。
（5）用稀釋2000 倍 的 5 : 10 : 5 營 養 液（Hyponex， Hyponex Japan) 燒灌植株。兩周大的植株在臭氧葉室中進行200 nL.L O3處 理 12 h (7)。臭氧葉室保持25°C ，7 0 % 相對濕度， 100 (umol DT2sH PPFD的連續光照培養條件。環境空氣中培養的植株作為實驗的對照組。臭氧由臭氧發生器（Sumitomo Seika Chemical, Tokyo, Japan) 產生。
###2 cDNA宏陣列的探針制備（8）
####（1） Poly (A )+ R N A 的提 取
1.利用硫氫酸胍-氯化銫超速離心法提取地上部分、花苞、根部、 2?6 周大的植株和水培幼苗的總 RNA (9)。
2.取 ％ 冷凍組織，在液氮中研磨成粉，加 人 25 mL 4 mol/L 硫氫酸胍緩沖液。
3.勻漿于室溫， 5000 g 離 心 10 min。
4.將上清液轉移到新的離心管中并加入等體積酸- 氯仿，混勻。
5.5000 g 室溫離心5 min。
6.將上清液轉移到新的離心管中，重復步驟4 和 5 四次。
7.取上清，置 于 離 心 管 中 的 氯 化 銫 墊 層（15 m L , 5.7 mol/' L ) 之上， 20°C ，271 000 g?離心 22 h，離心機轉子為 RP50VF (Hitachi Koki， Tokyo, Japan)。
8.棄去離心管上清，并將離心管倒置于紙巾上吸去多余液體。
9.用 7 0 % 乙醇室溫下清洗沉淀，棄上清，吸去多余液體。
10.RN A沉淀晾干，用 DEPC 水溶解。