cDNA克隆是以mRNA為原材料，經體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點是：
①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息；
③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。
1.方法：
(1)DNA片段的制備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產生cDNA。
(2)載體DNA的選擇：
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“松馳型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。
②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造后組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用于構建真核生物基因文庫和cDNA庫。
M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主制復，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。
③拷斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。
(3)DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用后就會產生粘性末端。
連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。
(4)引入寄主細胞：常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。