cDNA文庫的構建和篩選—在外界環境壓力條件下，新表達基因的鑒定方法實驗
實驗步驟
一、材料
所有化學試劑均為分子生物學級純度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸頭均經高壓蒸氣滅菌。涉及核酸的操作均需帶手套。
1.總 RNA提取
（1）無 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich) 到 I L 水中(0.1%， V/V) , 攪 拌 過 夜（> 1 2 h)，高壓蒸氣滅菌。這可使得存在于水中的RNase 失活，處理過的水用于本節中溶液的配制和溶解 RNA 樣品。
（2）TRIzo〖試 劑（Invitrogen)。
（3）氣 仿（Fisher Scientific)。
（4）異 丙 醇（Fisher Scientific)。
（5）7 0 % 乙醇，加 30 mL DEPC 處理的水至 70 mL 無水乙醇中。
（6）Oligo (dT) 纖 維 素（New England BioLabs， NEB)。干燥的 Oligo (dT) 纖維素與 0 ?I mol/L NaOH 混合使其成漿狀，填充入一個無菌的柱子或 I mL 滅菌棉花或者玻璃絲塞住的注射器。在加樣前先用上樣緩沖液平衡柱子。
（7）上樣緩沖液： lm ol/LNaCl， 2 mmol/L 磷酸緩沖液， PH7.2。
（8）洗漆緩沖液（middle wash buffer) : 上樣緩沖液+0.3 mol,+LNaCl。
（9）洗脫緩沖液（elution buffer): 10 mmol/L Tris——HCl， pH7. 2?7. 4 ， I mmol/LEDTA
（10）3 mol/L 乙酸鈉， pH 5. 2。
（11）乙醇。
2 cDNA 文庫的構建
3 CDNA 文庫的擴增
（1）NZY 平 板（24 cmX24 cm )， LB-氛卞青霉素肉湯， XLl-Blue 菌種 ， NZY 瓊脂，NZY 上 層 瓊 脂（見 2 中 第 19、 20 項）。
（2）TSM 緩 沖 液（見 2 中 第 16 項）。
（3）氯 仿（Fisher Scientific)。
（4）二 甲 亞 諷（DMSO; Sigma-Aldrich)。
4 cDNA 文庫差異表達的篩選
（1） NZY 平 板（24 cmX24 cm, 見 2 中第 19、 20 項）
（2）Hybond-14 0.45/1111 孔徑的尼龍膜（GE Healthcare)。
（3）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0. 3 mol/L 檸 檬 酸 鈉（I L 配方： 175 g NaCl， 88 g檸檬酸鈉）；用蒸餾水稀釋。
（4）變性緩沖液： I.5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。
（5）中和緩沖液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L Tris-HCl， pH 8. 0。
（6）沖洗緩沖液： 0.2mol/LTris-HCl， p H 8. 0, 2XSSC。
（7）Whatman 濾紙或層析紙（Fisher Scientific)。
（8）dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP 各 1 0 mmol/L)。
（9）固定的 Oligo (dT) 引物： 5’ - dT (15) A/G/C-3、 可 購 買 商 業 化 產 品（Invitrogen； New England Biolabs) 〇
（10）Nasin (20 U/μL, Promega)
（11）二 硫 蘇 糖 醇（DTT) (Sigma-Aldrich)，用無菌水配置成〇? I m ol/L 儲存液。
（12）A M V 反 轉 錄 酶（10 U/μL) 和 10X 反轉錄緩沖液（Promega)。
（13）[α-32P] dCTP (3000 Ci/mol; GE Healthcare) 。
（14）RNaseA (60 mg/mL, Sigma-Aldrich)0
（15）快 速 離 心 柱（quick spin column) (TE; Sephadex 0 2 5 ， Fine)，用于放射性標記的 DNA 純 化（Roche)。
（16）IX T wEl 緩沖液： 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。
（17）雜交緩沖液，改良的 Church’s 緩沖液： 0.25 mol/L Na2 HPO4, 0.25 mol/LNaH2 PO4 (PH 7. 5)， lmmol/LED TA， 7 % 十二烷基磺酸鈉（SDS; W/V );或夠買商業化的緩沖液； Ultrahybe (Ambion)。
（18）洗膜緩沖液（membrane washing buffer): 0. 1XSSC， 0 ?1 % SDS (W/ V)。
（19）膜清洗緩沖液（membrane rinsing buffer): 0.1 X SSC。
（20）X 光 片（Koda)。
(21)TSM 緩沖液：（見 2 中第 16 項）。
(22)氯仿（Fisher Scientific)。
(23)XLl-Blue 培養基。
(24) N ZY 上 層 瓊 脂（見 2 中第 19、 20 項）。
5菌體內克隆的檢出
(1)XLl-Blue 菌種。
(2)10 mmol/L MgSO4。
(3)ExAssist helper 嗤菌體。
(4)Uni-ZAP X R 噬菌體儲存液。
(5)LB- 氨芐青霉素肉湯（見 2 中第 18 項）。
(6)SOLR 細胞。
(7)L B 氨芐青霉素瓊脂平板： 15 g 瓊脂粉加至 L B 肉 湯 中（I L)，高壓蒸氣滅菌。冷卻至 50°C 以下鋪平板，加人氨芐西林（lOOpg/mL) , 用恰當厚度鋪板。
6 質粒的小量抽提
（1）LB-氨芐青霉素肉湯（見 2. 2 中第 18 項）。
（2）預裂解緩沖液： 5 0 mmol/L 葡萄糖， 2 5 mmol, LTris-HC1， p H 8. 0, lOmmol/LEDTA
（3）RNase A (見 4 中第 14 項）。
（4）堿裂解緩沖液：0. 2 mol/LNaOH， 1% S D S , 該溶液需用之前新鮮配制。
（5）中和緩沖液： 5 m olZL 乙酸鉀， 30% 乙酸， 50 mm 〇 r L 葡萄糖， 25 mmol/LTris-HCl， pH 8. 0， 10 mmol/L EDTA0
（6）異 丙 醇（FisherScientific)
7.70% 乙 醇（見 2. 1 中第 5 項）。
7 插入序列的分離
（1）限制性內切酶： E co R I 和 Xho I (N ew EnglandBiolabs); 可根據接頭調節。
（2）IOX 限制性內切酶緩沖液，使用限制酶所附帶的緩沖液。
（3）DNA 上樣緩沖液：0. 25% (W /V ) 二甲苯氰， 0. 25% (W / V ) 溴酚藍， 50% 甘油。
（4）1% T A E 瓊脂膠和 50X T A E 緩 沖 液（見 2. 2 中第 11、 12 項
（5）DNA 分子質量標準（Invitrogen)，由表達克隆片段的大小而定（從 100 bp 到幾kb)。
（6）帶濾芯的移液器吸頭（Im L )。
（7）滅菌棉花或玻璃絲。