cDNA文庫
[原理]：
cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。
l cDNA文庫的構建
分為六個階段：
階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈
階段2：cDNA第二鏈的合成
階段3：cDNA的甲基化
階段4：接頭或銜接子的連接
階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA
階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接
[階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈]
1．在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：
poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl
0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制劑（選用） 25單位
加H2O至 48μl
2．當所有反應組在0℃混合后，取出2.5μl反應液轉移到另一個0.5ml微量離心管內。在這個小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h。
4．溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然后轉移至冰上。
5．參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。
6．按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：
[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)
7．盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。
[階段2：cDNA第二鏈的合成]
1．將下列試劑直接加入大規模第一鏈反應混合物中：
10 mmol/L MgCl2 70μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000單位/ml) 1μl
大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl
溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。
2．溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中：
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl
室溫溫育15min。
3．溫育結束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合物室溫溫育15分鐘。
4．取出3μl反應物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質量。
5．將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6．將下列試劑加到DNA溶液中：
10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl
T4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1μl
室溫溫育15分鐘。
7．測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度，并按分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法測定1μl第二鏈合成產物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8．用下面公式計算第二鏈反應中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。
[第二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg
x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%
9．用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應物進行抽提。
10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。
11． 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。
12． 用70%乙醇洗滌沉淀物，重復離心。
13． 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。
14． 如果需要用EcoR I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。
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[階段3：cDNA的甲基化]
1．在cDNA樣品中加入以下試劑：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl
加H2O至 96μl
2．取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。
3．在余下的反應混合液中加入2μl EcoR I