構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接采用總RNA進行反轉錄而構建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構建成功的風險和文庫的代表性。至于RNA的質量，如果采用純化總mRNA后反轉錄，則對總RNA的雜質方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進行反轉錄，則對總RNA的質量要求非常高，不僅要求RNA相當完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質少，最好是試劑盒抽提的。