cDNA合成實驗

試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇dNTP隨機引物來自方案 4 的 RNA 樣品 RNasin反轉錄緩沖液

儀器、耗材 PCR 管子 熱循環儀

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

0.1mol/L 二硫蘇糖醇

dNTP(每種 2.5 mmol/L)

隨機引物（20~40U/ml)(1034731，RocheAppliedScience，Indianapolis，IN)

來自方案 4 的 RNA 樣品

RNasin(Promega)

5X 反轉錄緩沖液

主要反應組分混合物（X 樣品管數）

5X 反轉錄緩沖液                        10ul

dNTP(2.5 mmol)                          5ul

0.lmol/L 二硫蘇糖醇                    4ul

隨機引物                                     4ul

RNasin                                        1ul

Superscript0(18064-014,Invitrogen,Carlsbad*CA)試劑儲存于-20°C

2. 特殊設備

PCR 管子，0.2 ml

熱循環儀（比如，AppliedBiosystems7700sequencedetector;PEAppliedBiosystems，FosterCity,CA)

二、方法

1. 每管加入 24ul 反應混合物。

2. 加入 25ul 方案 4 得到的 RNA。

3.70°C 變性 5 min，冰浴 5 min。

4. 加入 lulSuperscriptII(最終反應體積 50ul)。

5.37°C、60 min 孵育，90°C 變性 5 min，冰浴 5 min。

6. 使用前，cDNA 樣品應當儲存于-20°C。