實驗概要
mESCs體內畸胎瘤形成和蘇木素-伊紅染色
主要試劑
mESCs培養液A或者B、無水乙醇、二甲苯、石蠟、4% PFA、伊紅染液、蘇木素染液、濃鹽酸、中性樹膠
主要設備
35 mm、60 mm、100 mm培養皿、15 mL離心管、50 mL離心管、細胞計數板、手術剪、載玻片、切片機、包埋機、烘箱、倒置顯微鏡
實驗步驟
（1）取1～2個培養皿（35 mm）的ES細胞，采用小鼠ES細胞傳代的方法將細胞消化成單細胞懸液，轉入無菌離心管中。
（2）加0.1～0.2 mL DPBS重懸，使細胞密度為0.5～1×107細胞/mL。
（3）取SCID小鼠，腹股溝注射（或腹腔注射）細胞懸液，每只鼠注射1×107個細胞。
（4）飼養小鼠，兩周后腹股溝可見腫塊。4～5周后處死小鼠，剝離腫塊，即畸胎瘤。
（5）對畸胎瘤進行切割，體積小于 5×5×2mm，放入組織盒中,4%PFA對切割好的畸胎瘤塊進行4℃過夜固定。
（6）首先用70% 乙醇脫水 1 小時（時間可以更長）；然后依次在80% 乙醇，90% 乙醇I，90% 乙醇II ，100%乙醇 I，100%乙醇 II 中各脫水1 小時。
！注意:此時可以預熱蠟箱。
（7）將脫水后的組織放在二甲苯 I中半小時；放在二甲苯 II 中半小時；放在二甲苯：石蠟（1：1）中半小時進行透明處理。
！注意:透明的時間要非常準確。
（8）將透明處理過的組織在溶解好的石蠟I中放置2 小時；然后在石蠟II 中放置2 小時。此時的浸蠟是在65℃的蠟箱中進行。
（9）取出組織盒中的組織塊，放入大小合適的蠟槽中。在包埋機中接蠟將組織塊包埋。
（10）包埋好的組織塊連同蠟槽開始冷卻，直至蠟汁凝固。
（11）首先取出蠟槽中凝固好的包埋有組織塊的蠟塊，對蠟塊邊緣進行修整。將修好的蠟塊固定在切片機上開始切片。
（12）小心地將切好的組織片放入事先準備好的水中，待組織片完全展開后，小心地將其貼到載玻片上，做好標記后放入37℃的烘箱中進行過夜烤片。
（13）將烤好的玻片浸入二甲苯I溶液中15min，再浸入二甲苯 II溶液中15min。然后梯度酒精入水（100%酒精----90%酒精----80%酒精----70%酒精----50%酒精---蒸餾水，每步各 5min）。
！注意: 脫蠟步驟應徹底，否則無論進行哪種染色都會發生困難。
（14）將玻片放入蘇木素水溶液中染色 5min。
！注意:時間過長核著色會非常深,要嚴格控制時間。
（15）將染色后的玻片放入0.1%鹽酸溶液（70%乙醇稀釋濃鹽酸至0.1%）中1~2s。
（16）然后放在水流下沖10min，不要直沖，傾斜著使水流能流過玻片。
（17）將沖洗過的玻片分別放在70% 和90% 酒精中脫水各5 min。
（18）脫水后的玻片放入伊紅染液中染色10min。
!注意：伊紅宜淡染，復染過深則導致細胞核不清晰，影響鏡檢.
（19）再用無水乙醇浸泡2-3min，起到透明作用，使得核與胞質分別明顯。
（20）最后用中性樹膠封固，觀察。
!注意：封固劑要適量，滴加時要小心傾滴，蓋玻片要輕輕放置，以免氣泡產生影響鏡檢；染好的切片應妥為保存，更應避免日光照射，否則切片容易褪色。
（21）觀察內、中、外三胚層結構（有上皮細胞，骨骼肌細胞，神經細胞，成纖維細胞，心肌細胞等；在切片中也可看到屬于各胚層的組織分化，如：神經纖維，角質化的復層扁平上皮，肌肉組織，軟骨、硬骨，各種上皮組織，腺腔、神經管等。