mRNA的提取及純化實驗——親和柱層析法

該方法利用mRNA上的寡聚A可與較聯寡聚T的纖維素柱在高鹽下以堿基配對形式發生親和吸附，而在低鹽下，堿基配對能力破壞，吸附解除，而其他成分的RNA則不具該特性，因此在高鹽下當RNA抽提樣品流經該柱時，mRNA被掛在柱上，而其他RNA則隨高鹽溶液流出；當用低鹽洗脫液洗柱時，mRNA隨洗脫液流出。再用有機溶劑沉淀則可得純化mRNA。

mRNA

十二烷基肌氨酸鈉EDTANaClTris-HCl洗脫液SDS

1.  DEPC處理層析柱。

2.  0.1 M NaOH處理Oliga(dT）－纖維素。

3.  用1×上樣液洗柱至pH< 8.0。

4.    無菌水溶解RNA，65℃溫浴5分鐘后，迅速冷卻至室溫，加等體積2×上樣液，上樣，分部收集。

5.  1倍體積1×上樣液洗柱，分部收集。

6.  OD₂₆₀沉淀收集液，確定收集液的該值是否接近0，如該值仍很大，則上樣液繼續洗柱，直至該值接近0。

7.  2~3倍柱床體積的洗脫液，洗柱，分部收集。

8.  測定各收集管的OD₂₆₀，將有吸光值的各管合并。

9.  在洗脫液中加入0.1體積的NaAC，1體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜，12 000 g 離心10 min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

10.  提取mRNA質量的分光光度計檢測，將所提mRAN分別在260，280 nm 比色，要求A.  OD₂₆₀%/ OD₂₈₀%不小于2.0及40 μg 所提樣品在OD₂₆₀%的值為1 。

11.  提取mRNA質量的電泳檢測，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應在0.5-8 Kb 間均勻著色，1.5-2 Kb 間著色較強。